Small Molecules as Tools in Biological Chemistry : Effects of Synthetic and Natural Products on the Type III Secretion System

• Main Author: Zetterström, Caroline E.
• Format: Doctoral Thesis
• Language: English
• Published: Umeå universitet, Kemiska institutionen 2013
• Subjects: Type III secretion; salicylidene acylhydrazide; virulence-blocker; virulence; inhibitor; target identification; neohopeaphenol A; Yersinia pseudotuberculosis; Pseudomonas aeruginosa; Escherichia coli
• Online Access: http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:umu:diva-70281; http://nbn-resolving.de/urn:isbn:978-91-7459-671-7 (printed); http://nbn-resolving.de/urn:isbn:978-91-7459-672-4 (digital)

The increasing use of antibiotics has led to a huge problem for society, as some bacteria have developed resistance towards many of the antibiotics currently available. To help find solutions to this problem we studied small molecules that inhibit bacterial virulence, the ability to cause disease. The type III secretion system (T3SS) is a conserved virulence system found in several gram-negative bacteria, including human and plants pathogens, such as Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia spp., Salmonella spp., Shigella spp, enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Erwinia spp. One class of virulence-blocking compounds is the salicylidene acylhydrazides. They were first identified in a screen towards the T3SS in Yersinia pseudotuberculosis and have since been shown to block the T3SS in a panel of gram-negative bacteria such as Chlamydia spp. Salmonella enterica, Shigella flexneri and EPEC. We designed and synthesized a library of 58 salicylidene acylhydrazides and evaluated their activity as virulence-blocking compounds in Y. pseudotuberculosis followed by calculations of quantitative structure activity relationships (QSARs). Four QSAR models were calculated, and when used in consensus they correctly classified between five out of eight compounds for Y. pseudotuberculosis as active or inactive and six out of eight compounds for C. trachomatis. Since the target and mode of action of the salicylidene acylhydrazides were unknown, we used solution and solid phase synthesis to synthesize three different affinity reagents. One of these affinity reagents was used in affinity chromatography experiments, where 19 putative target proteins from an E. coli O157 bacterial lysate were identified. We studied four of the proteins, Tpx, WrbA, FolX, and AdhE, in more detail in Y. pseudotuberculosis and E. coli O157. We believe that the salicylidene acylhydrazides act on multiple targets that together result in down-regulation of T3SS functions. A knockout of AdhE in E. coli O157 showed a similar phenotype as salicylidene acylhydrazide treated E. coli, suggesting that this protein may be particularly interesting as a drug target. Many of the antibiotics used today originate form natural sources. In contrast, most virulence-blocking compounds towards the T3SS are small synthetic organic molecules. Therefore, a prefractionated natural product library with marine and terrestrial biota samples was screened towards the T3SS in Y. pseudotuberculosis. Neohopeaphenol A was identified as a hit and shown to have micromolar activity towards Y. pseudotuberculosis and P. aeruginosa in cell-based infection models.  === Det ökande användandet av antibiotika har lett till stora problem för samhället. Många bakterier har utvecklat resistens mot de antibiotika som finns tillgängliga. För att försöka hitta en möjlig lösning på detta problem, arbetar vi med en strategi där vi med hjälp av små organiska molekyler inhiberar bakteriernas virulenssystem, deras förmåga att orsaka sjukdom. Traditionella antibiotika är antingen, bakteriocida, avdödande eller bakteriostatiska, tillväxthämmande. Bakteriernas enda sätt för att överleva antibiotikabehandlingen är att utveckla resistens. Forskarvärlden tror att molekyler som inhiberar bakteriernas virulenssystem, leder till ett minskat tryck att utveckla resistens mot dessa molekyler, eftersom de inte dödar eller hämmar bakterietillväxten, utan bara avväpnar bakterierna. Typ III sekretionssystemet är ett virulenssystem som finns i många gram-negativa bakterier, t.ex., Yersinia spp., Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia spp., Salmonella spp., Shigella spp, enteropatogena Escherichia coli (EPEC) och Erwinia spp. Salicylidenacylhydraziderna är en substansklass virulensblockare som inhiberar typ III sekretionssystemet i de ovan nämnda bakterierna. I denna avhandling har vi designat och syntetiserat ett bibliotek med 58 salicylidenacylhydrazider och utvärderat deras biologiska aktivitet som virulensblockare i Y. pseudotuberculosis. Vi relaterade den biologiska aktiviteten till de kemiska egenskaperna hos salicylidenacylhydraziderna i kvantitativa strukturaktivitetssamband. Med hjälp av dessa samband kunde vi prediktera och validera aktiviteten till aktiv eller inaktiv för fem av åtta nya salicylidenacylhydrazider i Y. pseudotuberculosis och sex av åtta i C. trachomatis. Eftersom verkningsmekanismen för salicylidenacylhydraziderna var okänd, så syntetiserade vi tre olika affinitetsmolekyler med kombinerad lösnings- och fastfas-syntes. En av affinitetsmolekylerna användes sedan för att ”fiska ut” och identifiera 19 potentiella målproteiner i ett bakterielysat från E. coli. Fyra av dessa proteiner, TpX, WrbA, FolX och AdhE har vi studerat vidare i Y. pseudotuberculosis och E. coli. Utifrån resultaten tror vi att salicylidenacylhydraziderna interagerar med flera proteiner som tillsammans resulterar i en nedreglering av type III sekretionssystemen. Vår samarbetspartner, Andrew Roe och hans forskargrupp (Universitetet i Glasgow), har studerat AdhE i E. coli.  De har visat att E. coli som saknar genen för proteinet AdhE, har samma fenotyp som E. coli behandlad med salicylidenacylhydraziderna, d.v.s. ett nedreglerat T3SS, vilket gör AdhE till ett speciellt intressant målprotein. I jämförelse med många av våra nuvarande antibiotika som har ett naturligt ursprung så är de flesta studerade virulensblockare små syntetiska organiska molekyler. Därför testades en stor kollektion av naturprodukter från marina och landlevande växter och invertebrater från Sydostasien, för att hitta nya inhibitorer mot typ III sekretionssystemet i Y. pseudotuberculosis. Neohopeaphenol A som kommer från barken på Hopea hainanensis, ett träd som växer i sydostasiens regnskogar, identifierades som en ny virulensblockare. Neohopeaphenol A visade sig vara en potent virulensblockare i in vitro infektionsförsök med Y. psudotuberkulosis eller Pseudomonas aeruginosa. Forskningen i denna avhandling visar att virulensblockare kan hjälpa oss att förstå hur bakterier orsakar sjukdom. Förhoppningsvis kan det i framtiden leda till nya typer av läkemedel mot infektionssjukdomar.