Identifiering av 13 nya mjölksyrabakterier med DHPLC

• Main Author: Livaja, Ruzica
• Format: Others
• Language: Swedish
• Published: Malmö högskola, Fakulteten för hälsa och samhälle (HS) 2011
• Subjects: DHPLC; PCR; Mjölksyrabakterier; Lactobacillus; Bifidobacterium; 16S rRNA; Physical Sciences; Fysik
• Online Access: http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:mau:diva-26310

Mjölksyrabakterier tillhörande släkten Lactobacillus och Bifidobacterium har nyligen upptäckts hos bin och i honungen de producerar och innefattar 13 nya arter[1]. Forskarna arbetar med att ta fram nya snabba och mer pålitliga identifierings metoder för att karakterisera dessa bakterier.I detta projekt undersöktes möjligheten att identifiera dessa bakterier med en ny metod som heter denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC). Metoden bygger på separation av PCR (polymerase chain reaction) amplifierade 16S rDNA fragment i DHPLC [8]. Vid identifiering av bakterier amplifierades olika variabla regioner från 16S rRNA genen, som påvisade efter sekvensering störst genetisk variation mellan dessa bakterier [1]. Separationen utfördes med ion-pair reverse-phase high presure liquid chromatoghaphy (IP RP HPLC) med delvis denaturering av DNA molekylen. Tidigare studier av identifiering av marina bakterier med DHPLC resulterade i optimal separation [9]. Identifiering av följande mjölksyrabakterier kunde verifieras till en viss grad. Analys i DHPLC visade profiler med urskiljbara toppar som utgjorde separation på artnivå, detta enbart mellan två bakterier tillhörande släktet Lactobacillus. Trots olika justeringar av analys parametrar gällande kolonntemperatur och elueringsbuffert, erhölls inte separation mellan alla 13 arter. Analysen kan ha påverkats av en rad olika funktionsfel i HPLC systemet och felaktig beredning av prov. Metoden kunde eventuellt förbättrats om tiden inte varit en begränsning. === Lactic acid bacteria belonging to genera Lactobacillus and Bifidobacterium has been recently discovered in bees and the honey they produce, and includes 13 new species [1]. Researchers are working to develop new rapid and more reliable detection methods to characterize these bacteria.In this project we investigate the possibility of identifying these bacteria with a new method called denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC. The method involves the separation of the PCR (polymerase chain reaction) amplified 16S rDNA fragments in the DHPLC [8].For the identification of bacteria various variable regions of 16S rRNA gene was amplified, sequencing proved great genetic variability between these bacteria [1]. Separation is effected by means of ion-pair reverse-phase high pressure liquid chromatography (IP RP HPLC) with partial denaturation of the DNA molecule.Previous studies of the identification of marine bacteria by DHPLC resulted in optimal separation [9]. Identification of the following lactic acid bacteria was verified to some limited degree. Analysis of the DHPLC demonstrated profiles with distinguishable peaks that represented the separation at the species level, that only between two bacteria of the genus Lactobacillus.Despite numerous adjustments of operating conditions such as existing column temperature and eluent buffer, did not result in separation of all 13 species. The analysis may have been influenced by a variety of malfunctions in the HPLC system and improper sample preparation. The method could possibly be improved if time was not a limitation.