| Summary: | Termen koliforma bakterier beskriver en grupp indikatororganismer som används för att bedöma renligheten och integriteten hos reningsverk samt distributionssystem som nyttjas vid dricksvattenproduktion. För närvarande ställer styrande förvaltningsmyndigheter endast krav på detektion av antalet koliforma bakterier i dricksvatten via odlingsbaserade metoder. Dessa odlingsbaserade metoder särskiljer och upptäcker koliforma bakterier, och Escherichia coli specifikt, baserat på deras tillväxt samt enzymatiska aktivitet på selektiva kromogena och fluorogena agarplattor. Den definition av koliforma bakterier som dessa lagstiftningar ger upphov till identifierar endast koliforma bakterier baserat på deras metabolism och enzymatiska aktivitet, vilket är otillräckligt för att taxonomiskt identifiera olika bakterier inom denna grupp. För att uppnå detta krävs en definition baserad på fylogenetik. Detta masterexamensarbete beskriver undersökandet av metoder för taxonomisk identifiering av koliforma bakterier baserade på en kombination av odlingsbaserade och molekylära metoder. Vattenprover från Mälaren och Lovös vattenverk i Stockholm användes för att isolera koliforma bakterier via membranfiltrering, följt av odling på selektiva medier. De isolerade kolonierna och membranfiltrerna användes för att extrahera genomiskt DNA, följt av amplifiering av specifika gener associerade med E. coli och koliforma bakterier via PCR. Dessa inkluderade lacZ-genen, uidA-genen, yaiO-genen och 16S rRNA-genen. Produkterna från lyckade genamplifieringar sekvenserades för att taxonomiskt klassificera sekvenserna och identifiera olika koliforma bakterier. Två vattenprover med inloppsvatten skickades även för metagenomisk analys av dess mikrobiom. Dessa resulta indikerade att ett odlingssteg var nödvändigt för att producera tillräckligt med biomassa och genomiskt DNA för att lyckas med genamplifieringar utan att behöva filtrera enorma mängder vattenprover. De utvalda primrarna uppvisade även varierande framgång i att amplifiera målgenerna hos koliforma bakterier. Bakteriekoloniernas fysiska utseende på de selektiva agarplattorna och resultaten från genamplifieringarna uppvisade inte sammanhängande resultat, vilket indikerar ett behov av att ytterligare undersöka och optimera de utförda PCR-protokollen. Trots detta visade metoden potential för taxonomisk identifiering av koliforma bakterier. 16S rRNA-gensekvenserna möjliggjorde identifieringen av potentiella kontaminanter som grampositiva bakterier (Micrococcus and Staphylococcus) och andra, icke-koliforma, gramnegativa bakterier (Pseudomonas and Aeromonas) på de selektiva agarplattorna. Denna information kombinerat med bakteriekoloniernas utseende på agarplattorna och resultaten från övriga genamplifieringar kan möjliggöra ett sätt att skilja på falska positiva, falska negativa, sanna positiva och sanna negativa resultat från nuvarande detektionsmetoder för koliforma bakterier. Ytterligare optimering av olika aspekter av metoderna och arbetsflödet kring identifiering av koliforma bakterier är nödvändig innan man kan införa ett liknande tillvägagångssätt i ett reningsverk. === The term coliform bacteria describes a group of indicator organisms used to measure the cleanliness and integrity of drinking water treatment plants and distribution systems. Currently, the only legal requirement set by government agencies pertains to the detection and enumeration of these bacteria via cultivation-based methods. These methods distinguish coliform bacteria and Escherichia coli based on their growth and enzymatic activity on selective chromogenic and fluorogenic agar plates. However, the legislative definition concerning their metabolism and enzymatic production is insufficient to identify bacteria within this group taxonomically. Instead, a definition based on phylogenetics is required. This master’s thesis describes the exploration of methods for the characterization and identification of coliform bacteria via a combination of cultivation-based and molecular methods. Water samples from Lake Mälaren and the Lovö drinking water treatment plant in Stockholm were used to isolate coliform bacteria via membrane filtration and cultivation on a selective agar medium. The isolated colonies and filtered membranes were subjected to DNA extraction, followed by gene amplification of target genes associated with E. coli and coliform bacteria via PCR. This included the lacZ gene, the uidA gene, the yaiO gene, and the 16S rRNA gene. Successful gene amplicons were sent for sequencing to assign taxonomic values to the sequences and identify coliform bacteria. Two inlet water samples were also sent for metagenomic analysis of the microbiome. An incubation step was necessary to gather enough biomass to extract sufficient genomic DNA for gene amplifications and avoid the need to filtrate large volumes of water. The selected primer pairs exhibited various degrees of success in amplifying the targeted genes of coliform bacteria. The physical appearance of coliform colonies on the selective chromogenic agar plates and the results from the gene amplifications displayed no discernable pattern, indicating the need to further investigate and optimize the PCR procedures. However, the method indicated a potential for coliform bacteria identification. 16S rRNA gene sequences allowed for the distinction of potential contaminants on the selective agar media in gram-positive bacteria (Micrococcus and Staphylococcus) and other non-coliform, gram-negative bacteria (Pseudomonas and Aeromonas). In conjunction with the physical appearance of bacterial colonies on selective media and successful gene amplicons of the targeted genes, this information could allow one to distinguish between false positive, false negative, true positive, and true negative results from current coliform detection and enumeration methods. Further optimization of various aspects of the coliform bacteria identification methods is necessary before introducing a similar approach to a water treatment plant context.
|
|---|
