Estudos estruturais com a importina-α do fungo Neurospora crassa e peptídeos de sequências de localização nuclear (NLS) de proteínas relacionadas ao metabolismo de fungos

• Main Author: Bernardes, Natália Elisa.
• Other Authors: Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" Instituto de Biociências (Campus de Botucatu).
• Language: Portuguese
• Published: Botucatu, 2018
• Subjects: Cristalografia.; NLS; ITC; Neurospora; NIT2; Crystallography
• Online Access: http://hdl.handle.net/11449/154866

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes === Resumo: A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Na Via Clássica de Importação Nuclear, a proteína Importina-α (Impα) atua na identificação das proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). Os primeiros estudos de caracterização estrutural da Impα de Neurospora crassa (NcImpα) e a sua estrutura cristalográfica mostraram a presença de regiões que podem estar relacionadas a especificidades da proteína NcImpα no reconhecimento de NLSs de proteínas de fungos. Além disso, foram reconhecidos prováveis NLSs em proteínas reguladoras do metabolismo de carbono e nitrogênio em fungos. O objetivo desse trabalho é identificar e caracterizar o modo de interação de NLSs de proteínas fúngicas com a NcImpα e verificar possíveis especificidades da proteína NcImpα no reconhecimento de NLSs. Os potenciais peptídeos NLS de proteínas dos fungos filamentosos N. crassa e Aspergillus nidulans foram submetidos a experimentos de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) com a proteína NcImpα, para calcular a afinidade entre as moléculas. Dentre os peptídeos testados, as sequências correspondentes ao potenciais NLS dos fatores de transcrição PAC-3, NIT-2, FLB-3, VOSA e VEA, apresentaram elevada afinidade com a NcImpα, conforme indicado pelos valores de Kd obtidos. Quando submetidos a experimentos de importação ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) === Abstract: The communication between the cell nucleus and the cytoplasm happens through transport mechanisms that allow the passage of molecules through pores present in the nuclear envelope. In the classical nuclear import pathway, the protein Importin-α (Impα) acts in the identification of the proteins to be transported to the nucleus from the recognition of nuclear localization sequences (NLS). The first structural characterization studies of N. crassa Impα (NcImpα) and its crystallographic structure showed the presence of regions that may be related to protein specificities in the recognition of fungal NLSs. In addition, NLSs were recognized in proteins related to fungal metabolism. The objective of this work is to identify NLSs in fungal proteins and observe the specificities of the NcImpα protein. Potential NLS peptides of N. crassa were subjected to isothermal titration calorimetry (ITC) experiments with NcImpα to verify and calculate the affinity of the complexes. Among the peptides tested, the sequences corresponding to the potentials NLS of the transcription factors PAC-3, NIT-2, FLB-3, VOSA and VEA, showed high affinity with NcImpα, as indicated by the Kd values obtained. When subjected to functional experiments with HeLa cells, the peptide NIT2-NLS were efficiently transported into the cell nucleus. Crystallization tests were performed to elucidate the structure of the complexes Impα/NLS peptides. A set of data from the NcImpα/ NIT2NLS complex was collected, with 99.71% comp... (Complete abstract click electronic access below) === Doutor