Caracterização funcional e estrutural da toxina GhoT de salmonella enterica e de peptídeos sintéticos derivados com pontecial capacidade de interação com membranas biológicas /

• Main Author: Carrijo, Rodolfo dos Santos.
• Other Authors: Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" Instituto de Química.
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Araraquara, 2018
• Subjects: Antibacterianos.; Membranas celulares.; Toxinas bacterianas.; Salmonella.; Bactericidas.; Bacterial toxins.
• Online Access: http://hdl.handle.net/11449/152998

Orientador: Reinaldo Marchetto === Co-orientador: Luiz Carlos Bertucci Barbosa === Banca: Fernanda Zanolli Freitas === Banca: Esteban Nicolás Lorenzón === Resumo: Sistemas toxina-antitoxina (TA) são tipicamente formados por dois genes que codificam uma toxina estável e uma antitoxina lábil. Esses módulos genéticos são diversos e abundantes em procariotos, sendo agrupados em seis tipos (I à VI) com base na natureza da antitoxina e no seu modo de interação com a toxina. O sistema TA GhoT/GhoS (tipo V) foi identificado em Escherichia coli, estando implicado no fenômeno de persistência celular (tolerância temporária à antibióticos). Embora a antitoxina desse sistema (GhoS) tenha sido bem caracterizada, os detalhes que envolvem a estrutura e os mecanismos de ação da toxina GhoT ainda não foram totalmente esclarecidos, sendo apenas demonstrado que a molécula in vivo ocasiona a formação de poros na membrana plasmática bacteriana, interrompendo a produção de ATP. Dessa maneira, considerando o potencial biotecnológico dos sistemas TA como alvos para o desenho de novos bactericidas, o presente trabalho caracterizou funcional e estruturalmente a proteína GhoT de Salmonella enterica e peptídeos derivados com capacidade de interação com membranas biológicas. Para isso, após a obtenção da sequência de aminoácidos da GhoT de S. enterica por BLAST e de sua predição estrutural in silico, a proteína e seus derivados (HN e HC) foram sintetizados pelo método químico em fase sólida, sendo purificados por cromatografia líquida de alta eficiência e identificados por espectrometria de massas. Em seguida, a capacidade de estruturação das moléculas foi avaliada com o auxílio da espectroscopia de dicroísmo circular. Já as suas funções foram investigadas através de ensaios de permeabilização de vesículas lipídicas, expressão heteróloga em bactéria e atividade antimicrobiana. Coletivamente, os estudos demonstraram que os polipeptídeos estão predominantemente enovelados em α-hélice, confirmando a modelagem estrutural realizada.... === Abstract: Toxin-antitoxin (TA) systems are typically formed by two genes encoding a stable toxin and a labile antitoxin. These genetic modules are diverse and abundant in prokaryotes and are grouped into six types (I to VI) based on the nature of the antitoxin and its mode of interaction with the toxin. The TA GhoT/GhoS system (type V) was identified in Escherichia coli, being implicated in the phenomenon of cell persistence (temporary tolerance to antibiotics). Although the antitoxin of this system (GhoS) has been well characterized, the details surrounding the structure and mechanisms of action of the GhoT toxin have not yet been fully elucidated, and it has only been shown that the molecule in vivo causes the formation of pores in the bacterial plasma membrane, disrupting the production of ATP. In this way, taking into account the biotechnological potential of TA systems as targets for the design of new bactericides, the present work characterized the GhoT protein of Salmonella enterica and derived peptides with interaction capacity with biological membranes. After obtaining the amino acid sequence of S. enterica GhoT by BLAST and its in silico structural prediction, the protein and analogues (HN and HC) were synthesized by the solid phase chemical method and were isolated by high performance liquid chromatography and identified by means of mass spectrometry. Then, the conformations of the molecules were evaluated with the help of circular dichroism (CD) spectroscopy. Its functions were investigated through lipid vesicle permeabilization assays, heterologous expression in bacteria and antimicrobial activity. Thus, collectively, the information revealed by the studies demonstrated that the polypeptides are predominantly anchored in α-helix, confirming the structural modeling performed. In addition, it was observed that the molecules retain the same lytic activity verified for the E. coli GhoT toxin, especially... === Mestre