Derivados de poli(L-lisina) com fosforilcolina para transferência gênica não-viral /

• Main Author: Semensato, Juliana.
• Other Authors: Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas.
• Format: Others
• Language: Portuguese; Portuguese; Texto em português; resumos em português e inglês
• Published: São José do Rio Preto, 2014
• Subjects: Físico-química.; Terapia gênica.; Polilisina.; Vetores genéticos.; Nanopartículas.; Fosforilcolina.; Gene therapy
• Online Access: http://hdl.handle.net/11449/111019

Orientador: Marcio José Tiera === Banca: Miguel Jafelicci Junior === Banca: Julio C. Fernandes === Resumo: A terapia gênica baseada em vetores não virais, tais como aqueles que se utiliza de sistemas poliméricos, é uma proposta promissora para o tratamento de doenças que se manifestam devido alguma disfunção gênica. Entretanto, o maior desafio desta técnica é a transferência do material genético, e a maioria dos esforços focaliza o desenvolvimento de vetores eficientes que possam transportar e transferir o DNA de modo seguro e eficaz. Neste trabalho, buscou-se sintetizar derivados de Poli(L-Lisina) (PLL) introduzindo o grupo fosforilcolina (PC) nos grupos amino da PLL, procurando-se variar os graus de substituição, com o objetivo de melhorar as propriedades deste vetor. A caracterização dos derivados foi realizada por RMN de hidrogênio, FTIR-ATR e GPC. O grau de substituição foi determinado com as técnicas de RMN de hidrogênio e potenciometria. A modificação da PLL com PC aumentou a capacidade de tamponamento dos derivados substituídos, o que pode melhorar a eficiência de transfecção. Estudos de interação entre PLL e PLL-PC com o DNA plasmidial VR1412 foram realizados em dois pHs (pH 5,0 e 7,4) por meio das técnicas de espectroscopia de fluorescência, eletroforese em gel de agarose, espalhamento de luz dinâmico e potencial zeta. Os resultados mostraram que os derivados são capazes de formar poliplexos e que a interação depende do grau de substituição, do pH, e da razão de cargas (razão N/P: razão de mol de grupos amino (polímero) por mol de grupos fosfato (pDNA)). Os estudos de espalhamento de luz dinâmico mostraram a formação de nanopartículas com diâmetros de 150 a 300 nm em pH 5,0 e de 350 a 700 nm em pH 7,4. As partículas exibiram carga superficial positiva (~ +25 mV em pH 5,0 e ~ +10 mV em pH 7,4), propriedade importante no processo de internalização dos poliplexos por endocitose. A viabilidade celular utilizando o ensaio colorimétrico com o MTS mostrou que proporções crescentes de PC podem ... === Abstract: Gene therapy based on non-viral vectors, such as those that utilize polymerics systems, is a promising treatment for diseases that arise due some genetic disorder. However the challenge of using this technique is the transfer of the genetic material and most of the efforts have focused on the development of effective vectors to efficiently deliver the DNA into the cells. In this work, the main purpose was to synthesize PLL derivatives containing increasing proportions of the group phosphorylcholine (PC), aiming to improve the PLL properties as a non viral vector. The derivatives were characterized by ¹H NMR, FTIR-ATR and GPC techniques. The degree of substitution was determined by ¹H NMR and potentiometry. The buffering capacity was evaluated and showed the grafting with PC groups increased the buffering capacity, which may improve the transfection efficiency. The interaction between PLL and PLL-PC derivatives and the plasmid VR 1412, was studied at two pH values (pH 5.0 and 7.4) by fluorescence, agarose gel electrophoresis, dynamic light scattering and zeta potential techniques. The results showed that all derivatives were able to form polyplexes depending on the degree of substitution, pH and the charge ratio (N/P, the ratio of amino groups to phosphate groups from the pDNA). Nanoparticles prepared using the coacervation process showed sizes varying from 150 to 300 nm at pH 5.0 and from 350 to 700 nm at pH 7.4. The particles exhibited positives surface charges (~ +25 mV at pH 5.0 and ~ +10 mV at pH 7.4) an important property for promoting the internalization process by endocytosis. Cell viability using the MTS colorimetric assay showed that increasing proportions of PC groups can reduce the cytotoxicity of nanoparticles, and IC50 values for the sinthesized polymers were graphically determined. The in vitro transfection efficiencies were shown to depend on the degree of substitution and N/P ratio and all the derivatives showed ... === Mestre