| Summary: | Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica, área de especialización Proteínas Recombinantes, y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico === La regulación de la expresión génica es un evento crucial para el músculo esquelético, ya
que determina la homeostasis y la plasticidad muscular, permitiendo la remodelación y
transformación del músculo para adaptarse a distintos estímulos. La actividad eléctrica
regula la expresión de diferentes genes del músculo esquelético por medio de un proceso
conocido como “Acoplamiento Excitación-Transcripción”. Se ha demostrado recientemente
que el ATP extracelular es un mediador esencial entre la estimulación eléctrica, la liberación
transitoria de calcio intracelular y la expresión de genes en el músculo esquelético.
Considerando que la regulación de la expresión génica esta mediada por la despolarización
de la membrana plasmática, la consecuente liberación de ATP y la activación de vías de
señalización intracelulares, este trabajo propone la existencia de un complejo multiproteico
en la membrana del túbulo-T, que favorecería la adecuada coordinación entre el sensor de
voltaje (Receptor de dihidropiridina, DHPR), el canal Panexina-1 (Panx1, liberador de ATP),
receptores purinérgicos (P2Y), otras proteínas de membrana como Distrofina y otras
moléculas intracelulares involucradas en la transducción de esta señal, como PI3Kγ.
Actualmente se sabe que diversos procesos de señalización celular son regulados por
complejos multiproteicos, un conjunto de proteínas asociadas para coordinar los distintos
pasos en una vía de transducción de señal.
Trabajo previo del laboratorio ha demostrado que DHPR interacciona con el canal de
Panx1. El objetivo general de esta tesis fue identificar nuevos componentes del complejo
multiproteico que regula el Acoplamiento Excitación-Transcripción, en células de músculo
esquelético L6 que expresan el canal Panexina-1 recombinante y en preparación de triadas
de músculo esquelético de ratón, mediante experimentos de co-inmunoprecipitación,
electroforesis bidimensional BlueNative, inmunofluorescencia indirecta y ensayos de
ligación por proximidad in situ.
Los resultados obtenidos mostraron que el canal Panx1 interactúa con DHPR y P2Y2 en
la membrana del túbulo-T. Además, por medio de co-inmunoprecipitación y ensayos de
ligación por proximidad, demostramos que las proteínas Distrofina, Caveolina-3 y PI3Kγ
también forman parte del complejo multiproteico que regularía el Acoplamiento Excitación-
Transcripción, en mioblastos y miotubos de células L6 que sobre-expresan el canal Panx1
recombinante. Los análisis de colocalización realizados en miotubos de células L6-Panx1
mostraron una asociación entre Panx1-DHPR, Panx1-PI3K y Cav-3-Panx1, considerando coeficientes de Manders superiores al 50% de colocalización. Al resolver triadas de ratón
usando la técnica de electroforesis bidimensional BlueNative SDS-PAGE, se demostró la
presencia de un complejo multiproteico que contiene a las proteínas Panx1, Cav-3 y DHPR.
Además, se logró identificar DHPR a partir de complejos aislados mediante la primera
dimensión del BlueNative, mediante espectrometría de masas.
Este estudio aporta nueva información respecto de cómo se organizan las proteínas
relacionadas con la plasticidad muscular, que participan en el al Acoplamiento Excitación-
Transcripción en el músculo esquelético. El entendimiento de este fenómeno tiene
importantes implicancias en procesos fisiológicos, como la respuesta del músculo frente al
ejercicio, y también con procesos patológicos que afectan al músculo esquelético como la
sarcopenia y las distrofias musculares. Los resultados obtenidos en esta Tesis permiten
abrir nuevas áreas de investigación relacionadas con el estudio de la relación entre el
acoplamiento Excitación-Transcripción y la fisiopatología musculoesquelética === Gene expression regulation is a crucial event for skeletal muscle, because
determines muscle homeostasis and plasticity that allows muscle remodeling for adapting
to environmental demands. Electrical activity regulates the expression of an important
number of skeletal muscle genes in a process known as “Excitation-Transcription Coupling”.
We have previously demonstrated that extracellular ATP is a relevant mediator between
electrical stimulation, intracellular calcium transients and gene expression in skeletal muscle
cells. Considering gene expression regulation is mediated by sarcolemma depolarization,
ATP release and specific signaling pathways activation, this work propose the assembly of
a multiprotein complex in T-tubules, allowing the proper coordination between the voltage
sensor (dihydropyridine receptor, DHPR), the pannexin channel (Panx1; ATP release
conduit), the P2Y nucleotide receptors, other membrane proteins such as Dystrophin, and
several intracellular molecules involved in signal transduction, such as PI3Kγ. It is currently
known that several cell signaling processes are mediated by multiprotein complexes, a
cluster of proteins associated to achieve coordinated steps in a transduction pathway.
Previous work in our laboratory has shown a likely protein-protein interaction
between Panx1 and DHPR. The general aim of this thesis was to identify new molecular
components of the multiprotein complex associated to Excitation-Transcription Coupling, in
L6 skeletal muscle cells which stably express a recombinant Panx1, and in mouse triads
preparation. We used co-immunoprecipitation, two-dimension Blue Native electrophoresis,
indirect immunofluorescence and proximity ligation in situ assays.
Our results showed a well-defined protein-protein interaction between the Panx1
channel, DHPR and P2Y2 receptor. Moreover, co-immunoprecipitation and Proximity ligation
assay results, identified the proteins Dystrophin, Caveolin-3 and PI3Kγ as participants of the
multiprotein complex involved in Excitation-Transcription coupling, both in myoblasts and
myotubes of L6 skeletal muscle cell line, stably expressing recombinant Panx1 protein. The
co-localization assays showed a well-defined association between Panx1-DHPR, Panx1-
PI3K and Panx1-Cav-3, considering Manders’s coefficients higher than 50%. Triads
samples resolution using BlueNative SDS-PAGE electrophoresis, evidenced a multiprotein
complex containing DHPR, Panx1 and Cav-3. Furthermore, we identified DHPR by mass
spectrometry, by complex isolation from 1D BlueNative gels.
This study provides new information about the organization of the proteins related to
muscle plasticity, involved in the Excitation-Transcription Coupling in skeletal muscles. The
understanding of this process has relevant implications in physiological processes, such as
the muscle response to exercise, and in pathological processes like sarcopenia and
muscular dystrophies. Results emanated from this Thesis will allow opening new research
areas related to clarify the association between Excitation-Transcription coupling and
skeletal muscle physiopathology === Fondecyt Regular Nº 1110467; Fondecyt de Iniciación N° 11100454; Proyecto Anillo ACT N° 1111; Beca CONICYT N°22120686
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