| Summary: | Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular === Las Gap Junctions (GJs) son clústers de canales intercelulares localizados en la
membrana plasmática que permiten la comunicación directa entre células adyacentes.
Cada canal GJ está compuesto por 2 hemicanales hexaméricos conocidos como
conexones, los cuales a su vez están compuestos por seis proteínas de
transmembrana llamadas conexinas (Cxs), siendo Cx43 la más representada en el
sistema inmune. Se ha vinculado la variación de los niveles normales de expresión de
las Cxs con la patogénesis de distintas enfermedades, incluyendo sordera congénita,
arritmias cardiacas y cáncer. Dentro de esta última nuestro laboratorio ha desarrollado
proyectos de investigación que permitan determinar el papel de las GJs en la respuesta
inmune antitumoral. Por ejemplo, publicaciones previas de nuestro laboratorio han
demostrado que Cx43 participa en la transferencia directa de antígenos tumorales
entre células dendríticas (DCs). Así mismo, Cx43 polariza hacia la sinapsis entre DC y
linfocitos T (LT) CD4+, formando canales funcionales que permiten una comunicación
bidireccional requerida para la activación de LT mediada por APC. Además, se ha
encontrado que Cx43 juega un rol en la activación de células natural killer (NK) por
parte de DCs y en la regulación de la citotoxicidad de las células NK contra células
tumorales. Así mismo, resultados no publicados indican que Cx43 polariza hacia el sitio
de contacto entre LT CD8+ citotóxicos (CTLs) y células de melanoma, sugiriendo que
Cx43 participaría en la citotoxicidad de CTLs en contra de éstas. Estos antecedentes
sugieren que las GJs podría participar en el transporte de moléculas o señales que se
encuentren involucradas en el proceso de activación de LT CD8+ mediada por DCs,
tema que aún no ha sido estudiado por las investigaciones actuales. En estudios
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anteriores nuestro laboratorio ha trabajado con modelos celulares humanos, sin
embargo, dado que la obtención de LT vírgenes específicos contra el tumor a partir de
donantes sanos es improbable y engorroso, en este trabajo decidimos utilizar el
modelo murino específico para melanoma pMEL-1 y validar y optimizar su utilización
para estudios de la participación de las GJs en la activación de LT CD8+ por parte de
DCs. Nuestros resultados indican que el modelo pMEL-1 no representa alteraciones en
la expresión de Cx43 respecto a su contraparte silvestre (wild type (WT)), y que es un
modelo muy sensible, encontrando expresión del marcador de activación CD69 incluso
desde 1 hora post co-cultivo. Además, se determinó que existe transferencia de
calceína entre moDC y LT CD8+ pMEL-1 en un contexto estrictamente antígeno
específico. Sin embargo, no pudimos dilucidar si las GJs participan del proceso de
activación ya que el método de inhibición utilizado, el cual es un péptido mimético de
Cx43, presentó problemas técnicos de funcionamiento, fenómeno que fue comprobado
en modelos donde anteriormente se había determinado la comunicación mediada por
GJs. Proponemos en el futuro utilizar otros métodos de inhibición, como el uso de
siRNA contra Cx43, para determinar si estos canales juegan un rol en este proceso. === Gap Junctions are clusters of intercellular channels located in the plasma
membrane that allow direct communication between adjacent cells. Each GJ channel is
composed of 2 hexameric hemichannels known as connexions, which are composed by
six transmembrane proteins called conexins (Cxs), being Cx43 the most represented
one in the inmmune system. Variation in normal expression levels on Cxs have been
linked to the development of different diseases, including congenital deafness, cardiac
arrhythmias and cancer, being the last the one where our laboratory has developed
investigation lines that allow to determine the role of GJs in the antitumoral response. In
example, previous publications of our group have demonstrated that Cx43 participates
in the direct transfer of tumoral antigens between dendritic cells (DCs) and that
polarizes to the synapsis between DCs and CD4+ T lymphocytes, forming functional
channels that allow bidirectional communication required for the DCs mediated
activation of LT. Besides this, we have found that Cx43 plays a role in the activation of
natural killer (NK) cells mediated by DCs, and in the regulation of the cytotoxicity of NK
cells against tumor cells. Likewise, unpublished data indicate that Cx43 polarizes to the
contact site between cytotoxic CD8+ T cells (CTLs) and melanoma cells, suggesting
that Cx43 participates in the cytotoxicity of these cells. These backgrounds suggest that
GJs may participate in the transport of molecules or signals that may be involved in the
process of DC mediated activation of CD8+ T cells, subject that hasn’t been studied by
the actual investigations. In previous studies our group has worked with human cellular
models, however, given that obtaining naïve T cells from healthy donors is unlikely and
difficult, in this work we decided to use the melanoma specific murine model pMEL-1
and valid and optimize it’s use for studies of the participation of GJs in the DCs
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activation of T cells. Our results indicate that the pMEL-1 model doesn’t have
alterations in the Cx43 expression levels compared with the wild type background and
that it is a very sensible model, in which we can evaluate the activation of T cells even
an hour after co-culture. Besides, it was determined the existence of calcein transfer
between moDCs and CD8+ pMEL-1 T cells in a strictly antigen specific context.
However, we could not elucidate if the GJs participate or not in the CD8+ T cell
activation process, as our inhibition method, which is a Cx43 mimetic peptide,
presented technical problems, phenomenon that was proven in models where GJ
mediated communication has previously been determinate. We propose in the future to
use a different inhibition method, as the use of anti-Cx43 siRNA, in order to determine if
these channels play a role in this process.
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