| Summary: | Magíster en Bioquímica
Área de especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular
y Memoria para optar al Título de Bioquímico === Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento === El uso de las nanopartículas de oro (NpO) ha adquirido importancia en los últimos años en
la industria farmacéutica debido a que se han convertido en una herramienta promisoria
para el diagnóstico y tratamiento de diferentes enfermedades, como aquellas que afectan
al sistema nervioso central (SNC). Poseen características útiles para su empleo en terapias,
como su pequeño tamaño y baja toxicidad. Sin embargo, estudios sobre los efectos de las
NpO administradas in vivo en el cerebro son escasos, debido a su poca capacidad de
atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) luego de una administración sistémica. Una
vez que están en el torrente sanguíneo, las NpO pueden ser captadas por el sistema
fagocítico mononuclear (SFM), reduciendo su concentración circulante y por tanto su
llegada al cerebro. A pesar de ello, recientemente se ha reportado un aumento de la
excitabilidad neuronal al administrar NpO directamente a cortes de hipocampo de ratón.
A su vez, se ha descrito que dependiendo de su forma, las NpO pueden interactuar con
células microgliales produciendo diferentes respuestas sobre éstas como activación
astrocítica. Sin embargo, en la actualidad es un desafío seguir las nanopartículas in vivo en
el cerebro para obtener información sobre sus acciones en el tiempo.
Por otra parte, las NpO pueden funcionalizarse con diferentes moléculas adquiriendo
selectividad frente a alguna molécula de interés. Así la conjugación de NpO con el péptido
anfipático CLPFFD, secuencia aminoacídica que reconoce agregados del péptido β-
amiloide característicos de la Enfermedad de Alzheimer, es capaz de unirse a las fibras y
provocar su desagregación posterior a una irradiación electromagnética de baja potencia.
Desafortunadamente, los niveles logrados en el cerebro, posterior a una inyección
intraperitoneal, aún son bajos como para que se constituyan en una herramienta
terapéutica para enfermedades neurodegenerativas asociadas a la formación de
agregados proteicos.
Con el fin de lograr obtener mayor información acerca de cómo se comportan las NpO in
vivo en el cerebro de rata, se utilizó un fluoróforo que permitiera estudiar la distribución de las nanopartículas en un modelo animal en el tiempo, es por ello que en esta tesis se
postuló la siguiente hipótesis "La fluorescencia asociada al péptido CLPFFD conjugado a las
nanopartículas de oro sirve como marcador de localización de éstas al ser inyectadas en
cerebro de rata. La administración aguda del conjugado fluorescente en hipocampo de
rata induce la reactividad astrocítica y muerte celular a nivel tisular".
Para ello se sintetizaron y funcionalizaron NpO con el péptido CLPFFD y el fluoróforo Alexa
750 (NpO-CLPFFD-Alexa 750), que tiene la particularidad de permitir su visualización in
vivo sin causar daño en la rata producto de la irradiación ya que absorbe y emite en la
región del infrarrojo cercano. Con el objeto de obtener información sobre la difusión de
este conjugado tras ser inyectado directamente en el sistema nervioso central de rata
adulta, se determinó si era posible detectar (I) las NpO-CLPFFD-Alexa in vivo a nivel de un
cerebro animal, (II) un cambio de intensidad de la fluorescencia en un período acotado de
tiempo, (III) una correlación de dichos cambios con la variación en los niveles de oro en el
cerebro a las temporalidades estudiadas. Las NpO funcionalizadas con el péptido y el
fluoróforo se inyectaron mediante cirugía estereotáxica a animales machos adultos
anestesiados en las coordenadas correspondientes al hipocampo dorsal y a nivel de los
ventrículos laterales.
Finalmente se determinó si las NpO producen alteraciones a nivel celular. Con el objeto de
poder detectarlas en cortes de cerebro de rata mediante microscopia, las NpO-CLPFFD se
conjugaron con un fluoróforo que emite en la región del UV visible, el Alexa 647. Los
animales fueron inyectados con el conjugado a nivel de la región CA1 hipocampal, y
posteriormente fueron sacrificados a los 10 min o luego de 24 h post inyección. Se
determinó fluorescencia a nivel del hipocampo sólo en aquellos animales que fueron
sacrificados casi inmediatamente tras la inyección de las NpO. En aquellos animales
sacrificados luego de 24 h post-inyección no se detectó señal fluorescente en cortes
coronales anteriores y posteriores del sitio de inyección. Estos resultados podrían
interpretarse como que (I) la molécula fluorescente se desconjugó del péptido de manera
espontánea, (II) la desconjugación ocurrió a través de la acción de enzimas hidrolíticas presentes en sitios aledaños a la inyección, (III) el conjugado fluorescente se eliminó del
cerebro lo que es coincidente con la reducción observada en el contenido de oro en el
cerebro luego de 24 h post inyección del conjugado fluorescente.
Con el propósito de determinar si la inyección de las nanopartículas conjugadas era capaz
de inducir daño tisular, se determinó 24 h post inyección mediante tinción nuclear la
ausencia de núcleos condensados y segmentados característicos de muerte celular por
apoptosis. Paralelamente se determinó la reactividad astrocítica como respuesta a daño
tisular, para ello se evidenció el incremento en la inmunoreactividad de la proteína GFAP
presente en las células gliales, encontrándose una mayor reactividad astrocítica 24 h post
inyección en el área del giro dentado en aquellos animales inyectados con nanopartículas
respecto de los animales controles.
En este estudio se demostró por primera vez de manera ex vivo que las nanopartículas de
oro asociadas a un péptido generan un aumento en la reactividad de la glía, la cual no está
asociada a muerte celular en cerebro animal tras 24 h de una inyección intracraneal
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