| Summary: | Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario === Trypanosoma cruzi, un protozoo hemoflagelado, es el agente causal de la enfermedad de
Chagas, patología endémica de Latinoamérica que se ha extendido al resto del mundo. Este
parásito presenta un ciclo de vida indirecto y se transmite principalmente mediante insectos
hematófagos triatominos a distintos hospederos mamíferos, incluyendo el ser humano.
Dentro de los mecanismos no vectoriales de transmisión de la enfermedad, los más
importantes son la transfusión sanguínea y la infección transplacentaria. La enfermedad
cursa en tres fases progresivas: aguda, indeterminada y crónica, pudiendo causar
discapacidad e incluso la muerte. Las drogas utilizadas como tratamiento de esta patología
son poco eficaces en el tratamiento de la fase crónica, además de generar numerosos
efectos colaterales indeseados, siendo necesario desarrollar nuevas drogas más eficientes en
la eliminación del parásito y más inocuas para el paciente.
Para que se establezca una infección crónica, T. cruzi debe resistir el daño oxidativo al
DNA generado por las células del hospedero. La sobrevida de los parásitos se relacionaría
con la capacidad de reparación del DNA, donde en el caso de mamíferos la fosforilación de
la histona H2AX en el residuo Ser139 sería fundamental. En tripanosomátidos no se han
identificado genes ortólogos para H2AX, pero en T. brucei se detectó que la histona H2A
canónica es fosforilada en el residuo Thr130 como consecuencia de daño al DNA, residuo
que se conserva en otros tripanosomátidos y que en el caso de T. cruzi corresponde a
Thr131. La participación de este último en la respuesta al daño del DNA aún no se ha
comprobado.
Se realizaron tres mutaciones sitio-dirigidas diferentes en la secuencia nucleotídica que
codifica para el residuo Thr131 de H2A de T. cruzi, reemplazándolo por alanina (incapaz de
ser fosforilada), ácido glutámico y ácido aspártico (que simulan una fosforilación
permanente del sitio). Las secuencias nucleotídicas silvestres y mutantes fueron insertadas
en el vector pTREX-HIS8-GFP y expresadas como proteínas de fusión con GFP en
epimastigotes de T. cruzi.
Se comprobó la expresión exitosa de las proteínas en T. cruzi mediante visualización
directa por microscopía de fluorescencia, inmunofluorescencia y mediante ensayos de
vi
Western blot. Las histonas marcadas con GFP se localizan a nivel de núcleo, lo cual sugiere
una asociación con la cromatina del parásito, debiendo confirmarse su incorporación
efectiva al nucleosoma mediante estudios posteriores. Otra tarea a futuro consiste en
determinar si efectivamente el residuo Thr131 de H2A de T. cruzi se fosforila como
respuesta al daño del DNA.
Los resultados permiten concluir que es posible generar líneas de epimastigotes de T. cruzi
que expresen de manera estable la histona H2A tanto de fenotipo silvestre como de
fenotipos mutantes para el residuo Thr131, utilizando el vector pTREX-HIS8-GFP. Los
epimastigotes que expresan estas proteínas se encuentran disponibles para realizar ensayos
de viabilidad comparativa frente a la exposición con agentes genotóxicos, lo que podría
determinar un posible nuevo blanco terapéutico para la enfermedad de Chagas. === Proyectos Fondecyt 11100053 y 1130113
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