| Summary: | Doctor en Ciencias con mención en Microbiología === La microcina E492, una bacteriocina formadora de poros, es producida y secretada por Klebsiella pneumoniae RYC492. El sistema genético de la microcina se clonó en Escherichia coli obteniéndose una microcina recombinante con las mismas propiedades que la producida por K. pneumoniae. Este antibiótico es sintetizado como un precursor, con un péptido líder (PL) N-terminal que es procesado concomitantemente con la exportación hacia el medio extracelular. El PL de la microcina E492 es del tipo doble glicina, lo que indica que la microcina E492 sería exportada a través de un aparato transportador ABC dado que comúnmente este sistema transportador es el encargado de exportar proteínas con esta clase de PL. El objetivo de este trabajo fue estudiar el procesamiento y exportación de la microcina E492. Mediante la caracterización de mutantes por transposición en el sistema genético de la microcina se estableció que participan tres genes en la exportación de la microcina: mceG, que codifica para el transportador ABC, mceH, para la proteína accesoria y mceF, para un factor adicional nunca antes descrito, por tanto, de función desconocida. Los aparatos transportadores ABC además están normalmente constituidos por una proteína localizada en la membrana externa. Para determinar cual es la proteína de membrana externa que forma parte el aparato transportador ABC de la microcina se utilizó una mutante en el gen tolC. La mutante tolC¯ no es capaz de exportar microcina, función que recupera al ser transformada con un plásmido que lleva el gen tolC. Así, TolC es la proteína de membrana externa que forma parte del aparato transportador ABC de la microcina en E. coli. Las proteínas candidatas de procesar el PL de la microcina son MceG y MceF. Proteínas homólogas a MceG poseen un dominio N-terminal encargado de procesar el PL. Por otro lado, la secuencia de MceF sugiere que sería una proteasa de membrana interna y una mutante carente de MceF produce una proteína de un tamaño superior que correspondería a la microcina no procesada. Los estudios de western blot de medios sobrenadantes y de fracciones totales y subcelulares obtenidos de las mutantes mceG¯ y mceF¯ indican que MceG procesa el PL de la microcina conjuntamente con MceF. Aparentemente MceF interviene en el reconocimiento junto con MceG de la microcina precursora y facilitaría que el dominio de líder-peptidasa de MceG encuentre a la microcina precursora para procesarla. MceG y MceH presentan una identidad cercana al 90% con el transportador ABC de la colicina V (CvaB) y su proteína accesoria (CvaA). En este trabajo se estudió la relación funcional que existe entre el sistema transportador de la microcina E492 y de la colicina V y sus respectivos péptidos líder tratando de establecer el papel que juega MceF en este proceso. Se realizó un análisis funcional combinando los componentes del sistema exportador de la microcina y de la colicina V, cuyo resultado indica que la colicina V puede emplear el transportador ABC y la proteína accesoria de la microcina E492 para su secreción únicamente cuando está presente la proteína MceF. Por el contrario, la microcina E492 no puede usar el transportador de la colicina V para alcanzarel medio extracelular, y la proteína accesoria CvaA complementa parcialmente la falta de su homólogo MceH en la exportación de la microcina E492. Así, la complementación funcional no es recíproca aún cuando la similitud entre ambos sistemas es muy alta y la exportación vía MceGH de ambas bacteriocinas requiere de MceF. La secuencia del PL de la microcina presenta en común cinco de los nueveaminoácidos conservados en la secuencia consenso de esta clase de péptidos líder. Los aminoácidos que difieren pueden ser importantes para el procesamiento, como la glicina en la posición –1, ya que los residuos más importantes del PL del tipo doble glicina son las dos glicinas ubicadas en las posiciones -1 y –2. La microcina presenta una alanina en la posición –1, en cambio la colicina V posee la mayoría de los aminoácidos de consenso incluyendo las dos glicinas mencionadas. Se construyeron proteínas quimeras fusionando el PL de la colicina V a la microcina madura y viceversa con el fin de determinar la importancia de los aminoácidos no conservados en el PL de la microcina y la relación que puede haber con MceF. La microcina quimera fue exportada por ambos sistemas exportadores en conjunto, en cambio, la colicina V quimera, a través de su propio aparato transportador. Comúnmente las señales de exportación que dirigen el tránsito hacia el medio extracelular de las proteínas exportadas por sistemas transportadores ABC están ubicadas en el extremo C-terminal. Sin embargo el PL podría también dirigir la exportación de estas proteínas. Se estudió el rol que tiene el PL en la exportación de la microcina clonando el gen de la microcina sin PL en un vector que permite modular la expresión del gen. Al expresar el gen, no se detectó microcina extracelular, además las células crecieron deficientemente, sobreviviendo solo las que lograron rearreglar su DNA, excluyendo el fragmento perjudicial. En el experimento control con PL, la microcina pudo ser exportada y las células crecieron saludables. Esto indica que el PL dirige la exportación de la microcina y evita el efecto deletéreo de ella sobre la célula. === Microcin E492, a channel-forming bacteriocin, is produced and secreted by Klebsiella pneumoniae RYC492. This antibiotic is synthesized as a precursormolecule, with an N-terminal leader peptide that is processed concomitant with the export to the extracellular space. The microcin leader peptide belongs to double-glycine-type leader peptides that are common in colicin V and bacteriocins produced by gram-positive bacteria. This property suggests that microcin E492 would use an ABC-transporter apparatus (Type I secretion) for its secretion. The aim of this work was to study the general features of the microcin E492 export and processing. Studying a set of mutants obtained through transposition, we found that three genes participate in the microcin export: mceG, that encodes for an ABCtransporter, mceH, for the accessory protein (also called MFP) and mceF for an additional factor not described in the literature, with an unknown function. In addition, the microcin E492 ABC-transporter apparatus is also formed by TolC, a protein localized in the outer membrane. The cleavage of microcin leader peptide could be achieved by either MceG or MceF. MceG protein homologues have an N-terminal domain that frequently cleaves the leader peptide of its cognate bacteriocin. On the other hand, the sequence analysis of MceF indicates that this protein could be a leader peptidase localized inside the inner membrane. Microcin prepared from a mutant in mceF gene showed a higher molecular weight that of microcin. Since this protein is recognized by an antibody against microcin most likely corresponds tothe microcin precursor. Western blot experiments of supernatants and whole-cell fractions as well as subcellular fractions obtained from mutants in mceG and mceF genes suggest that the ABC transporter processes the leader peptide of microcin with the assistance of MceF. A possible role of MceF could be the recognition of microcin in order to present it to MceG for processing. Transporter proteins of microcin (MceG and MceH) have an identity near to 90% with the ABC transporter of colicin V (CvaB) and its accessory protein (CvaA), respectively. In this work we studied the functional relationship that existsbetween the transporter apparatus of microcin and colicin V. The functional analysis was done through complementation between the transporter genes of microcin and colicin V. The results indicate that colicin V can use the ABC transporter and accessory protein of microcin (MceG and MceH) to be exported only when mceF gene is present in the genetic system. On the other hand, microcin cannot use the CvaB transporter, and for microcin secretion CvaA can complement only partially the lack of its homologous MceH. These studies indicate that the functional complementation is not reciprocal, and the exportation of microcin and colicin V via MceGH requires the additional factor MceF. The leader peptide sequence of microcin shares five amino acids of the nine residues found in consensus sequence of double-glycine leader peptides. The residues that are different could be important for cleavage, as it occurs with the glycine in position –1, since the most important residues of this kind of leader peptides are the two glycines situated in –1 and –2 positions. The microcin leader peptide contains an alanine in position –1 instead of the glycine of consensus. On the other hand, the colicin V leader peptide has almost all residues of the consensus sequence along with the glycines in –1 and –2 positions. To determine the importance of these amino acids of microcin in the leader peptide, we constructed chimeric bacteriocins composed by colicin V leader peptide fused to the mature form of microcin and vice versa. The chimeric microcin was exported by the combination of both colicin V and microcin transporter apparatuses, in contrast with the chimeric colicin V protein, that was exported by its own complex. Usually the exportation signals that allow proteins that are exported by ABC transporter systems are localized in their C-terminal region of the exported protein. However, in the case of small proteins such as bacteriocins, the leader peptide could also conduct their exportation. In order to study the role of the leader peptide, we cloned the microcin gene without the sequence encoding the leader peptide in a vector that allows a strict control of gene expression. When we expressed the leaderless microcin gene, no microcin was detected in theextracellular space. Cells grew poorly, surviving only the cells that were able to make a DNA re-arrangement to displace the harmful fragment, while, in the control experiment, cells carrying microcin that contained the leader peptide, grew healthy and exported microcin. This result suggests that the leader peptide is not only necessary for microcin exportation but avoids toxic effect of intracellular microcin.
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