| Summary: | Memoria para optar al título profesional de Bioquímico === Tradicionalmente se ha abordado el estudio del control del metabolismo analizando las
propiedades de los componentes de un sistema (enzimas, transportadores y otros) aislados del
sistema completo. Durante las dos últimas décadas se han desarrollado algunas teorías para
analizar el comportamiento de sistemas metabólicos completos con una aproximación sistémica,
entre ellas la llamada análisis del control metabólico. Esta teoría considera los sistemas
metabólicos como un todo; así, la respuesta del flujo original (δJ) a un pequeño cambio en la
actividad de una enzima (δe) será entonces consecuencia de todas las variaciones de las
concentraciones de intermediarios. Esta respuesta puede ser cuantificada por el coeficiente de
control del flujo. En este trabajo se intentó determinar qué grado de control ejercen en la
regulación del flujo de la vía directa de síntesis de glicógeno las enzimas UDP-glucosa
pirofosforilasa (UGPasa) y glicógeno sintasa (GS), usando como modelo experimental los oocitos
en estadio VI de rana Caudiverbera caudiverbera.
UGPasa cataliza la reacción UTP + glucosa-1-P ⇔ UDP-glucosa + PPi. Ésta es una reacción que
se encuentra en todos los organismos hasta ahora estudiados. Además de su función clave en la
síntesis de disacáridos y polisacáridos, la enzima es esencial en la síntesis de la parte carbohidrato
de glicolípidos, glicoproteínas y una variedad de metabolitos secundarios.
La actividad de UGPasa en extractos crudos de oocitos de C. caudiverbera se midió en el sentido
de la formación de UDP-glucosa por electroforesis capilar. Las corridas se realizaron en un capilar
no protegido de 57 cm de longitud y 50 μm de diámetro, a un voltaje de 22 kV. La señal del
nucleótido se determinó a 254 nm. Cuando se aplicó el método para medir la actividad de la
enzima en extractos crudos se obtuvo una curva de tiempo lineal durante un tiempo experimental
apropiado. La reacción reversa se midió por el método espectrofotométrico, acoplando y
cuantificando la formación de NADPH a 340 nm.
La actividad endógena de la enzima en oocitos resultó ser alrededor de 12 mU/oocito. La enzima
presenta actividad máxima a pH 8,5. En relación a las constantes cinéticas para los sustratos de la
reacción reversa, se encontró que la enzima tiene cinética sigmoidea para pirofosfato, con un K0,5
de alrededor de 460 μM y un nH mayor que 2,0. La cinética para UDP-glucosa es hiperbólica, con
una Kmapp de 50 μM.
Para la determinación del coeficiente de control de la enzima se procedió a inyectar en los oocitos
cantidades crecientes de UGPasa pura. Se usó la enzima comercial de Sigma. Dado que ésta contenía impurezas, se procedió a purificarla por medio de una columna de exclusión molecular.
La enzima microinyectada en los oocitos permaneció activa durante el tiempo que duraban los
experimentos. El coeficiente de control para la enzima UGPasa en la vía directa de síntesis de
glicógeno fué 0,15 y en la vía indirecta, 0,05.
La glicógeno sintasa ha sido considerada tradicionalmente la enzima reguladora de la síntesis de
glicógeno, pero estudios in vivo han puesto en duda esta afirmación. No existe enzima comercial
disponible y no fue posible obtener enzima pura en la concentración adecuada para la
microinyección. Como alternativa se procedió a la activación de la enzima por medio de glucosa-6-
P. Los experimentos para determinar el efecto de la glucosa-6-P sobre la GS se realizaron
microinyectando diferentes concentraciones de glucosa-6-P. Después de 8 min se procedió a la
microinyección de UDP-[U-3H]glucosa 3 mM. Después de 12 min de incubación, se midió la
radiactividad en glicógeno. La activación máxima de la enzima fue entre 2 y 3 veces a 2 mM de
glucosa-6-P inyectada. El efecto del éster fue transitorio, siendo máximo entre 5 a 10 min. Para la
determinación del coeficiente de control se microinyectaeon diferentes concentraciones de glucosa-
6-P. Después de 8 min de incubación los oocitos recibieron [U-14C]glucosa (6 nmoles). Después de
12 min incubación, se midió la radiactividad en glicógeno. El coeficiente de control para GS en la
vía directa de síntesis de glicógeno fue igual a 0,01.
Los coeficientes de control de las otras enzimas de la vía han sido previamente determinados en el
laboratorio. Para hexoquinasa resultó ser de 0,6 y para fosfoglucomutasa de 0,2. Según el teorema
de la suma, la suma de los coeficientes de control de todas las enzimas en una vía metabólica es
igual a 1.
Para el caso de la síntesis de glicógeno, la suma de los coeficientes de control de las enzimas en la
vía directa en oocitos de anfibio fue 0,96. Esta es la primera vez que se determinan todos los
coeficientes de control de una vía metabólica completa en un sistema in vivo. === Traditionally metabolic control and regulation has been studied by analysing the properties of the
system components (enzymes, transporters and others) isolated from the whole system. During the
last two decades, new proposals have emerged to analyze the behaviour of complete metabolic
systems with a systemic approximation. Among them is the so called Metabolic Control Analysis.
This approach considers the metabolic system as a whole; thus, the response of the original flux
(δJ) to a small change in the activity of one enzyme (δe) will be then the consequence of all the
variations of the intermediate concentrations. This response may be quantified by the flux control
coefficient. The aim of this work was to determine the involvement of the enzymes UPD-glucose
pyrophosphorylase (UGPase) and glycogen synthase (GS) on the control of the flux through the
direct path way for glycogen synthesis. Oocytes stage VI from C. caudiverbera were used as an in
vivo experimental model.
UGPase catalyzes the reaction UTP + glucose-1-phosphate ⇔ UDP-glucose + PPi. This is a
reaction found in all the organisms so far studied. Besides its key function in the synthesis of
disccharides and polysaccharides, the enzyme is essential in the synthesis of the carbohydrate part
of glycolipids, glycoproteins and a variety of secondary metabolites.
The activity of UGPase in crude extracts from C. caudiverbera oocytes was measured in the
forward formation of UDP-glucose by capillary electrophoresis. Separations were performed in a
non protected capillary of 57 cm long and 50 μm diameter, at a voltage of 22 kV. The signal of the
nucleotide was determined at 254 nm. When the method was applied to measure the enzyme
activity in crude extracts, a linear time curve was obtained during an appropiate experimental time.
The reverse reaction was measured by the spectrophotometric method, coupling and quantitating
the formation of NADPH at 340 nm.
The endogenous activity of the enzyme in oocytes was about 12 mU/oocyte. The enzyme presents
maximum activity at pH 8,5. In relation to the kinetic constants for the substrates of the reverse
reaction, it was found that the enzyme has sigmoidal kinetics for pyrophosphate, with a K0,5 of
about 460 μM and a nH higher than 2.0. The kinetic for UDP-glucose is hyperbolic, with a Kmapp of
50 μM.
To determine the control coefficient of the enzyme, increasing quantities of pure commercial
UGPase, were microinjected into the oocytes. Because the enzyme was not homogenous, it was
purified by molecular exclusion. The microinjected enzyme inside the oocytes remained active
during the time of the experiments. The control coefficient for UGPase in the direct path way for
glycogen synthesis was 0.15 and 0,05 in the indirect way.
Glycogen synthase has been traditionally considered the regulatory enzyme of glycogen synthesis,
but studies in vivo have questioned this statement. There is no commercial enzyme available and
it was not possible to obtain pure enzyme in the proper concentration for microinjection in our
laboratory. As an alternative, activation of the enzyme by glucose-6-P was chosen. The
experiments to determine the effect of glucose-6-P on GS were carried out by microinjecting into
the oocytes different concentrations of glucose-6-P. After 8 min, microinjection of 3 mM UDP-
[U-3H]glucose was performed. After 12 min incubation, the radioactivity on glycogen was
measured. The maximum activation of the enzyme was between 2-3 times at 2 mM glucose-6-P.
The effect of the ester was temporary, being maximum between 5 to 10 min. To determine the
control coefficient into the cells, different concentrations of glucose-6-P were microinjected . After
12 minutes incubation, the radioactivity in glycogen was measured. The control coefficient for GS
in the direct pathway for synthesis glycogen was 0.01.
The control coefficient of the other enzymes of the pathway have been previously determined in
the laboratory. For hexokinase it was 0.6 and for phosphoglucomutase, 0.2. According to the
summation theorem, the sum of the control coefficients of all the enzymes involved in a metabolic
path is equal to 1. In the case of glycogen synthesis pathway, the sum of the control coefficients of
the enzymes in the direct route in amphibian oocytes was 0.96. This is the first time that all control
coefficients for a complete metabolic pathway are determined in a system under in vivo conditions.
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