| Summary: | Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctora en Bioquímica === La depresión es una de las formas más frecuentes de los trastornos del ánimo y es una de las enfermedades mentales más frecuentes en Chile. Aunque la etiología de la depresión mayor aún no es completamente comprendida, se ha propuesto una alteración en el sistema nervioso central (SNC). Esos cambios también se correlacionan con una reducción o un aumento de los factores de crecimiento en áreas específicas del cerebro. Los tratamientos farmacológicos para este trastorno, mejoran la biodisponibilidad de serotonina o noradrenalina a través del bloqueo de la recaptación de estos neurotransmisores por los terminales nerviosos presentes en estructuras del SNC.
Diversas evidencias muestran que factores genéticos y ambientales tales como eventos estresantes podrían contribuir al desarrollo de los desórdenes psiquiátricos. El estrés crónico aumenta el tono nervioso simpático y la respuesta neuroendocrina del eje hipotalámico-hipofisario-adrenal provocando la secreción de corticoides adrenales. Alrededor del 50% de los pacientes con depresión muestran niveles mayores de corticoides.
En modelos animales, se ha mostrado que los corticoides afectan ciertas regiones del cerebro promoviendo atrofia dendrítica principalmente en neuronas de la corteza prefrontal y del hipocampo, una estructura relacionada con procesos de memoria y aprendizaje. También se ha informado de una reducción y cambios en la morfología de las espinas dendríticas, que corresponden a compartimentos celulares especializados e implicados en la transmisión sináptica. Los cambios en la arborización dendrítica, la morfología de las espinas dendríticas y las proteínas de adhesión celular importantes para el reconocimiento de los componentes pre-y postsinápticos (por ejemplo, N-cadherina / β−catenina) son eventos fundamentales tanto para la formación de circuitos neuronales como para el procesamiento de información. Estas modificaciones probablemente estén relacionadas con el funcionamiento del citoesqueleto, a través de un proceso dinámico de la extensión y retracción de los árboles y las espinas dendríticas; formando un contacto sináptico apropiado. La atrofia observada en algunas áreas cerebrales sugiere que la depresión se asocia con alteraciones en la remodelación dendrítica en neuronas. Aunque se desconoce el mecanismo celular que da cuenta de los cambios morfológicos observados en las dendritas,es probable que en la depresión se encuentren afectadas las vías transduccionales que controlan la polimerización de la actina y de los microtúbulos.
Se ha postulado que los neurotransmisores como la serotonina y la noradrenalina regulan dinámica de la actina en las espinas dendríticas a través del reclutamiento de reguladores de la actina. Entre éstas están las Rho-GTPasas (familia de proteínas G pequeñas), que transducen las señales extracelulares hacia el citoesqueleto de actina con lo que se regula la polaridad del axón y la formación de sinapsis durante el desarrollo. En cultivos organotípicos de hipocampo, la RhoA está presente en el árbol dendrítico y las espinas dendríticas co-localizado con F-actina. Por otra parte, el dominante negativo de RhoA inhibe el crecimiento axonal y aumenta el crecimiento dendrítico de las neuronas del hipocampo. La cofilina es un efector de la señalización de RhoA, que en su forma activa (desfosforilado) mejora la despolimerización de actina y el corte de F-actina.
Se ha postulado que la serotonina y la noradrenalina regulan la dinámica del citoesqueleto de actina a través del reclutamiento de moduladores de actina. Entre éstos están las Rho-GTPasas (familia de proteina G pequeña), las cuales transducen señales extracelulares al citoesqueleto de actina regulando la polaridad del axón, formación de sinopsis durante el desarrollo. En cultivos organotípicos de hipocampo, RhoA está presente tanto en los árboles y espinas dendríticas, colocalizando con F-actina. Más aún, dominantes negativos de RhoA, inhiben el crecimiento axonal, incrementando el crecimiento dendrítico de neuronas hipocampales. Cofilina es un efector de la señal de RhoA, la cual en su forma activa (desfosforilada) aumenta la depolimeración de F-actina.
Durante los cuadros depresivos, también podrían establecerse modificaciones en las proteínas relacionadas con el reconocimiento sináptico y el mantenimiento de las conexiones neuronales. Entre estas proteínas, se ha definido la importancia de la interacción entre N-cadherina y β-catenina la cual se ha asociado con la remodelación de sinapsis. Además, β-catenina puede actuar como factor de transcripción regulando la expresión de algunos genes neuronales. Los niveles de β-catenina pueden estar regulados por fosforilación mediante la GSK3β, modificación que estimula su degradación por el proteosoma. La GSK3β también ha sido implicada en varias funciones celulares, como la dinámica del citoesqueleto al participar en la fosforilación de proteínas asociadas a los microtúbulos, tales como Tau, MAP-1B y MAP-2. Recientemente se ha descrito la activación GSK3β a través de un mecanismo dependiente de RhoA. Estos resultados indican que GSK3β podría actuar como un regulador clave de la conectividad sináptica a través de β-catenina y/o en la remodelación de las dendritas.
Basado en estas evidencias, se propuso la siguiente hipótesis: El estrés crónico por restricción de movimiento, como modelo de depresión animal, provoca cambios tanto conductuales como en los niveles de proteínas asociadas a citoesqueleto y conectividad sináptica, efectos prevenidos por el antidepresivo sertralina.
Para estudiar esta hipótesis, ratas machos Sprague-Dawley, fueron sometidas a restricción de movimiento por 2,5 h/día durante 14 días. Estos animales fueron inyectados crónicamente vía i.p. con solución salina, 10 mg / kg de sertralina. El estrés crónico redujo la ganancia de peso, incluyendo la reducción en la preferencia por una solución de sacarosa al 1% como agua de bebida, lo cual es análogo a una conducta depresiva. También estos animales mostraron una reducida adquisición de respuestas condicionadas, lo cual se correlaciona con los impedimentos en las habilidades cognitivas. El estrés por restricción provoca déficit en la conducta de escape en la prueba de evitación activa e incrementa la inmovilidad en la prueba de nado forzado, señalando con esto una conducta de desesperanza aprendida. El tratamiento con antidepresivo en animales no estresados mejora en un 30% la capacidad de respuestas condicionadas respecto del control y promueve un 5% el fracaso de la prueba de falla en el escape.
Estos cambios sugieren que el estrés crónico afecta circuitos neuronales y por lo tanto fue importante evaluar cambios en la densidad de espinas de neuronas piramidales del hipocampo, como una medida de la conectividad neuronal y también de proteínas relacionadas con conectividad sináptica y citoesqueleto. La administración de sertralina en animales no estresados induce una reducción en la densidad de espinas dendríticas basales de las neuronas piramidales del área CA1, efecto que podría estar relacionado a los impedimentos cognitivos observados en los animales. De igual, modo los animales estresados mostraron una reducción en la densidad de espinas dendríticas en el área CA1, efecto que no pudo ser prevenido por la administración de sertralina. Así, es posible que cambios en la morfología de las espinas pudieran explicar en parte, lo observado en aprendizaje asociativo y las conductas de desesperanza aprendida en animales tratados crónicamente con antidepresivo.
El estrés por restricción redujo la inmunorreactividad de N-cadherina, pero no de catenina, en la región del estrato oriens correspondiente al área CA3 del hipocampo. Este efecto fue parcialmente prevenido por sertralina. Además la administración de sertralina a los animales controles promovió un aumento en la inmunorreactividad de β-catenina en el estrato oriens de CA3. Por el contrario, los animales sometidos a estrés y tratados con sertralina mostraron un aumento en la inmunorreactividad de β-catenina pero no de N-cadherina en la región correspondiente al estrato oriens de CA1; este resultado se condice con el aumento de β-catenina observado en los ensayos inmunológicos. Tanto el protocolo de estrés como la administración de sertralina a animales controles y sometidos a estrés, promovió un aumento en los niveles de GSK3β en extractos de hipocampo. En estas condiciones se observó una reducción en el valor de la razón pGSK3β/GSK3β. Los extractos hipocampales de los animales sometidos a estrés mostraron un incremento en los niveles de RhoA, efecto que no pudo ser prevenido por el tratamiento con sertralina. El aumento de Rhoa no se correlacionó con los cambios en p-cofilina.
Se puede concluir que el estrés y el tratamiento con sertralina producen efectos diferenciales en el hipocampo, que involucran cambios en los niveles de proteínas relacionadas con la conectividad sináptica. Estos resultados abren una nueva vía de investigación centrada en los mecanismos de acción de los antidepresivos. === Depression is one of the most frequent forms of mood disorders and one of the most prevalent mental diseases in Chile. Although the etiology of major depression is not yet fully understood, it has been proposed an impairment of serotonergic and/or noradrenergic neurotransmission within the central nervous system (CNS). These changes are also correlated with a reduction or even an increase in growth factors in specific brain areas. Pharmacological treatments for this disorder are designed to improve serotonin or noradrenaline bioavailability through a blockade of their reuptake from neuron terminals in CNS structures.
Several evidences showed that genetic and environmental factor such as stressful life events may contribute to the development of this psychiatric disorder. Chronic restraint stress increases the sympathetic nervous tonus and the neuroendocrine response of hypothalamic-pituitary-adrenal axis triggering the secretion of adrenal corticoids. About 50% of depressed patients show increased levels of corticoids. It has been shown in animal models that corticoids affect certain brain regions promoting dendrites atrophy mainly in neurons of prefrontal cortex and the hippocampus, a structure related with processes of memory and learning. Also it has been reported changes in the morphology and reduction in the number of dendritic spines, which correspond to specialized cellular compartments involved in the synaptic transmission. Changes in dendrite arborization, spine morphology and cell-adhesion proteins are important for the recognition of pre- and postsynaptic components (eg. N-cadherin/β−catenin) and also are critical for neural network formation and information processing. These modifications probably involve the cytoskeleton and could occur through a dynamic process of extension and retraction of both dendritic tree and spines to form an appropriate synaptic contact. Previous research suggests that depressive disorder is associated with impairments in dendrite remodeling of neurons based on the atrophy observed in some brain areas. Although the precise cellular mechanism underlying the morphological changes in dendrites is still unknown, it is probable that transductional pathways controlling actin and microtubule polymerization could be affected in major depression. It is postulated that serotonin and noradrenalin neurotransmitters regulate spines actin dynamics through the recruitment of actin regulators. Among these are the Rho-GTPases (small G protein family) which transduces extracellular signals to the actin cytoskeleton thereby regulating axon polarity, formation of synapses during development. In hippocampal organotypic culture, RhoA is present in the dendritic tree and dendritic spines in clusters co-localized with F-actin. Moreover, a negative dominant of RhoA inhibits axonal growth while increases dendritic growth of hippocampal neurons. Cofilin is one effector of RhoA signaling, which in its active form (dephosphorylated) enhances the F-actin depolimerization and severing. Also in major depression is important to establish modifications in proteins related to synaptic recognition and maintenance of neural connections. Among these proteins, the interaction between N-cadherin and β-catenin has been associated with synapse remodeling. Also, β-catenin can act as transcription factor regulating the expression of some neural genes. The levels of β-catenin can be regulated by GSK3β phosphorylation, a modification that stimulates its degradation by the proteasome. The GSK3β also has been implicated in several cellular functions, including cytoskeleton dynamics by phosphorylation of microtubule associated proteins such as Tau, MAP-1B and MAP-2. Recently it has been described GSK3β activation through RhoA-dependent mechanism. These results indicate that GSK3β could act as a key regulator of synaptic connectivity through β-Catenina and/or in dendrite remodeling. Based on these evidences, following hypothesis was stated:
Chronic stress by restraint of motion, such as animal model of depression, causes changes in both behavioral and levels cytoskeleton-associated protein and synaptic connectivity, effects prevented by sertraline antidepressant.
To study this hypothesis, male Sprague-Dawley rats were subjected to 2.5h of daily restraint stress during 14 days. These animals were chronically injected with either saline or 10 mg/kg sertraline, i.p. Chronic restraint stress reduced the body weight gain and increased adrenal gland weight, being both effect not prevented by sertraline treatment. Chronically restrained animals showed depression-like behaviors including reduction in the preference for a 1% sucrose solution as drinking water, which resembles anhedonic behavior. Also this animals showed a reduce acquisition of conditioned responses, which correlates with impairments in cognitive abilities. Restraint stress elicited escape deficit in the active avoidance test and increased immobility in the forced swim test, behaviors indicative of learned helplessness. Antidepressant treatment to unstressed animals reduced acquisition of conditioned avoidance response in a 30% in comparison to controls and promoted 5% escape failures. These changes suggest that chronic stress affects neural circuitry and therefore it was important to evaluate changes in the spine density of pyramidal neurons of hippocampus as a measure of neuron connectivity and also in proteins related to synapse connectivity and cytoskeleton. Sertraline administration to unstressed animals elicited a reduction in spine density of basal dendrites of CA1 pyramidal neurons, effect which can be related to the cognitive impairment observed in these animals. Similarly, stressed animals revealed a reduction in spine density of CA1 dendrite, effect which could not be prevented by sertraline administration. Thus it is feasible that changes in spine morphology could explain the recovery observed in associative learning and helplessness in animals treated chronically with antidepressant.
Restraint stress reduces N-cadherin but not β-catenin immunoreactivity in CA3 stratum oriens, an effect partially prevented by sertraline. Also, sertraline administration to control animals promoted an increase in β-catenin immunoreactivity in stratum oriens of CA3. In contrast, stressed animals treated with sertraline showed an increase in β-catenin but not in N-cadherin immunoreactivity of CA1 stratum oriens, a result in accordance with the rise of β-catenin observed in immune western assay. The stress protocol and the administration of sertraline to control and stressed animals promoted an increase in GSK3β determined in hippocampal extracts. In these conditions, a reduction in the ratio pGSK3β/ GSK3β was observed. Hippocampal extract of stressed animals showed an increase in RhoA levels, an effect not prevented by sertraline treatment. Also the increase in RhoA levels was not correlated with changes in p-cofilin. It may be concluded that stress and sertraline treatment produce differential effect on the hippocampus involving changes in proteins related to synaptic connectivity. These findings give new insights in antidepressant mechanisms of action. === FID-1998-2001 === MECESUP 2005-2009
|
|---|
