Comparison of 1,6-Dinitropyrene DNA Adducts in Different Human Lung Cell Lines and Its Mutation Spectrum in The hprt Locus of Chinese Hamster Ovary K1 Cells.

• Main Authors: Tang, Te-Wei, 湯德瑋
• Other Authors: Huei Lee, Ph. D.
• Format: Others
• Language: zh-TW
• Online Access: http://ndltd.ncl.edu.tw/handle/97801179117741332962

碩士 === 中山醫學院 === 生物化學研究所 === 84 === 1,6-DNP 是一種具有基因毒性和致癌性的硝基多環芳香烴，廣泛存 在於空氣懸浮微粒中，主要來自柴油車和汽機車之排放廢氣。已知 1,6-DNP 對細菌、哺乳類細胞都具非常強的致突變性，在動物實驗方面， 也可促使老鼠的肺臟、肝臟或其他器官的腫瘤發生。過去本研究室在分析 台灣地區四個主要都會區─台北、新竹、台中和高雄，均發現空氣懸浮微 粒中主要的致突變化合物可能是 DNPs，同時也證明高雄縣茄萣鄉之廢五 金回收區燃燒廢電纜會產生高量的 1,6-DNP 和 1,8-DNP，是該地區空氣 中主要的空氣污染物。 另外，燃燒塑膠廢棄物和保麗龍等人工合成物 也會產生高量的 1,6-DNP 和 1,8-DNP，因 此推測露天燃燒垃圾等廢棄物 可能是造成 DNPs 含量較其他國家高 100-1000 倍的原因之一。因此本研 究以 32P-postlabeling 方法，探討 1,6-DNP 在人類肺細胞上形成 DNA 鍵結物的能力和在動物肺細胞有何不同﹖同時亦欲了解 1,6-DNP 在 HPRT/CHO-K1 的致突變分析上，所引發的突變株的 HPRT 基因有何基因突 變的特異性 ( mutational specificity )，擬由以上實驗了解 1,6-DNP 在台灣地區肺癌發生上是否扮演重要的角色。 在 1,6-DNP 引起 DNA 鍵結物的實驗，本研究共使用了七種人類肺細胞株和兩種動物細胞株 ，各以 34.2 然 1,6-DNP 處理細胞 24 小時，並以 32P-postlabeling 的方法，分析各種細胞所產生之 1,6-DNP-DNA 鍵結物和標準品 1,6-DNP- DNA 鍵結物 dG-C8-ANP 之圖譜 ( profile ) 是否相似，同時也比較其形 成量。初步結果顯示，1,6-DNP 在人類肺細胞株上所形成的主要 DNA 鍵 結物，與我們製備之小牛胸腺 DNA 所形成的 dG-C8-ANP 標準品，在 TLC 片上的移動位置明顯不同，而 1,6-DNP 在動物細胞株上所形成的主要 DNA 鍵結物，則與標準品 dG-C8-ANP 具有相似的移動位置，同時也發現 1,6-DNP 在九株實驗細胞株中，對 MRC-5 正常肺細胞株會形成最高量的 DNA 鍵結物，其次是倉鼠肺細胞 V79 和另一種人類正常肺細胞 WI-38， 而 CaLu-1、CL1-0、CL1-2 和 CL-3 等四種人類肺癌細胞株，在本實驗所 用的 1,6-DNP 最高濃度下並沒有偵測到任何 1,6-DNP-DNA 鍵結物的含量 ，其他五種細胞株則各形成二到三個 1,6-DNP-DNA 鍵結物。 另外 ，1,6-DNP 在 HPRT/CHO-K1 所造成的基因突變特異性上，發現 1,6-DNP 所引起的 23 個獨立突變株有 18 個是單一鹼基更換突變 ( single base substitutionmutation )，4 個是剪輯錯誤突變 ( splice site mutation )， 還有 2 個是缺失突變( deletion mutation )。進一步分 析 18 個鹼基更換突變的突變形式，發現有 72%( 13 / 18 ) 是屬於換異 突變 ( transversion )，其中又以 A : T → C : G 和 G : C→ C : G 鹼基更換突變為主要的突變形式，各佔 28% ( 5 / 18 )。而 2 個缺失突 變，都是移除一個 C 鹼基，且都發生於 C 鹼基的重覆序列。另外 4 個 突變株所造成的剪輯錯誤大多發生於 exon 4 上，其頻率高達 75% ( 3 / 4 )。由以上分析結果得知，1,6-DNP 所造成之 HPRT 基因的突變特異性 ，以鹼基更換突變為主，佔了 75% ( 18 / 24 )，而其中又以 A : T → C : G 以及 G : C → C : G 的換異突變為主要的突變形式。 若分析單 一鹼基更換突變發生的位置時，發現有 78 % ( 14 / 18 ) 是發生在 HPRT 基因的 exon 5到 exon 8 之間，而因剪輯作用 ( splicing process ) 錯誤發生的突變有 75% ( 3 / 4 )是發生在 exon 4。 由以上兩個實驗結果可初步了解 1,6-DNP 會在人類正常肺細胞株上，尤 其是MRC-5 細胞上形成一個和已知 1,6-DNP-DNA 鍵結物 dG-C8-ANP 不同 的未知 DNA 鍵結物。另又知 1,6-DNP 所引起之哺乳類細胞的基因突變主 要是 A : T → C : G 以及 G : C →C : G 兩種鹼基更換突變，這結果 和過去學者所做的也有不同。或許本研究結果能在1,6-DNP 與人類肺癌關 係上提供一些訊息。