Gene cloming of the capsid protein of infectious pancreation necrosis virus (IPNV)

• Main Authors: HONG, WEN-LING, 洪紋玲
• Other Authors: XU, YA-LI
• Format: Others
• Language: zh-TW
• Published: 1992
• Online Access: http://ndltd.ncl.edu.tw/handle/53503771843342273784

碩士 === 東吳大學 === 生物學研究所 === 80 === T42G病毒為本實驗室在1987年鹿谷養鱒場發生大量鱒魚死亡時，由其病魚體所分離 到的一種具兩段雙股核醣核酸病毒，在分類上屬於Birnaviridae，為感染性胰臟壞 ▔▔▔▔▔▔ 死病毒（infectious pancreatic necrosis virus, 簡稱IPNV）之VR-299電泳型。 其基因體大小為Ａ段3.8kb 及Ｂ段3.2kb ，分別轉譯四個病毒蛋白（Ａ段）及核醣 核酸轉錄酵素(RNA transcriptase) （Ｂ段）。本實驗 T42G 病毒的 cDNA 是利用 hexanucleotide當作random primer 或用專一性引導子(specific primers)及反轉 錄酵素(reverse transcriptase) 來合成的，雙股核醣核酸的第一階段變性條件， 以處理一次所合成之cDNA的產率優於處理兩次者，且當引導子與核醣核酸模板之用 量比例由0.5:1 提高至1:1 時，所合成之cDNA的分子變大。針對殼蛋白所設計的四 個專一性引導子，各別使用來合成T42G cDNA ，由結果顯示，Ａ、Ｂ兩個專一性引 導子與T42G核醣核酸模板anneal情形較差，Ｃ、Ｄ兩組合成cDNA之分子較大，可達 2.0kb ，且Ｄ之專一性引導子合成cDNA量最多。此合成之cDNA連接於pGEM7zf(-)之 EcoRI 位置，再轉形(transform) 至大腸桿菌JM109 中。利用EcoRI切割及DNA dot hybridization 分析不具β－半乳糖分解酵素(β-galactosidase)活性的選殖株， 顯示共有13株來自於Ａ段基因體及１株來自於Ｂ段基因體，其大小在Ａ株群為0.2 至0.8kb，在Ｂ株則為0.3kb。其彼此間之重疊關係經過交叉交(cross hybridizat- ion)實驗後得知，八個較大的Ａ選殖株clone7, 53, 1, 33, 90, 94, 97, 100插入 DNA 的兩端已被定序出來，並已找出其在基因體上的位置，但由於插入DNA 可能存 在有難以變性的二級結構，所以目前仍無法將插入DNA 的全長序列均讀出，現正以 傳代無性繁殖系(subclones) 的方法改善此一缺失。