Improvement of the phenol-utilizing yeast, candida tropicalis and development of its host-vector system by biotechnology

• Main Authors: JIANG, XUAN-YI, 江選毅
• Other Authors: ZHANG, MIN-ZHENG
• Format: Others
• Language: zh-TW
• Published: 1992
• Online Access: http://ndltd.ncl.edu.tw/handle/45572843647064794278

碩士 === 國立成功大學 === 生物化學研究所 === 80 === Candida tropicalis是一株由自然界中經過濃縮培養篩選而得的，具有資化酚類能力 的不完全酵母菌，此菌株不僅能夠在 17mM，1500ppm高濃度的酚類碳源培養基裡生長 ，更可利用烷類或脂肪酸大量增生peroxisome，以誘發參與Ｂ-oxidation pathway之 酵素生成；因此無論就探討酚類代謝機制，亦或是peroxisome增生之調節作用，開發 其宿主載體系統實有其必要性。 有關宿主系統之構築，我們利用各種變異原加以抗生素濃縮之方式，篩選到四株腺嘌 呤 (Ade)之營養要求變異株，並命名為A-1，A-2，A-3，A-4，其中A-2與A-4之復歸率 均小於10 -7,再與S.cerevisiae重組菌X2181，XJ151進行細胞融合之實驗中，發現 A-2為 Ade1之突變種，再加以穩定性高之優勢，所以選擇其為宿主。而在載體部份， 利用 YEp13所構築的C.tropicalis基因庫形質轉換至SHY3(Ade1)細胞中，藉以選殖 ADE1基因當作標誌，此基因選殖工作目前仍處於一未完成的階段。 另一方面，C.tropicalis資化酚類是利用鄰位裂解途徑來進行，且此途徑上之首要酵 素phenol hydroxylase必須在酚類碳源的誘導下才能產生，若以葡萄糖為碳源則完全 無法偵測出活性。我們亦利用變異原濃縮篩選酚類資化欠損變異株，而得到四株無法 以酚類為碳源的突變種，命名為P-13，P-14，P-15，P-17，經過細胞萃取物之酵素分 析結果，發現P-17是屬於phenol hydroxylase缺失且相當穩定的變異株，而其餘三株 穩定性則較差。 進一步的實驗，利用P-15，P-17及A-1，A-2為母株，在 PEG-CaCl2的幫助下進行細胞 融合，如此得到十株酚類資化能力增強的融合株，達成菌種改良的目標；其中並有 F-3，F-4可在含22mM，約1950 ppm之酚類單一碳源的固態培養基上生長，顯現其超強 能力；而經過細胞萃取物之酵素分析結果，證實融合株F-3，F-4之phenol hydroxylase單位活性比黟生種高出一倍左右，如此似乎代表著由於 phenol hydroxylase 活性增強，造成融合株可布更高濃度的酚類培養條件下生長，亦即 phenol hydroxylase很可能負責了酚類代謝途徑上之速率決定步驟。