Expression and site-directed mutagenesis of alkaline elastase gene of alkalophilic bacillus sp. Ya-B

• Main Authors: ZHANG,HONG-GUANG, 張宏光
• Other Authors: CAI,YING-JIE
• Format: Others
• Language: zh-TW
• Published: 1990
• Online Access: http://ndltd.ncl.edu.tw/handle/57099400034681335422

碩士 === 國立陽明大學 === 生物化學研究所 === 78 === Alkalophilic Bacillus sp.Ya-B 的生產之菌體外鹼性彈性蛋白 (alkaline elast- ase)，對彈性蛋白(elastin) 有極高之分解力，其最適反應pH為 11.75。由其已確定 之DNA 序列得知此酵素之一級結構和subtilisin有60% 相似度，為subtilisin fami- ly之一員。此酵素之基因已複殖於E.coli及B.subtilis中，將載有鹼性彈性蛋白 基 因(ale) 之雙向質體pEX301經原生質體轉形法送入不同的中性Bacillus宿主，經長時 間培養之下，由菌液之中可測得酵素之活性，而經由西方墨點法，可確切偵測鹼性彈 性蛋白 之存在。由(ale) 基因在三種不同B.subtilis宿主表現都較原母株表現為慢 來看，ale 基因之表現是受宿主之控制，此機制很可能與Bacillus之產孢有密切關係 。 Ale 基因在E.coli之中是不表現的，我們將已去除啟動子之ale 基因，接在可由葡萄 糖酸(gluconate) 誘導而起動的gluconate operon之後，希望可以表現ale 基因。當 加入誘導劑gluconate 後，gluconate operon啟動，可在分子量 34，000，約為ela- stase pro-enzyme所在位置處發現額外蛋白質帶，可能是未經熟成作用之鹼性彈性蛋 白 ，而此蛋白質帶隨時間之增加而逐漸消退，顯示此產物之安定性不佳。誘導表現 之後，在分子量 66，000左右亦發現一額外蛋白帶，其可能為fusion-protein，故此 operon表現ale 基因之情形仍較微弱。 本實驗利用定位突變法改變ale 基因，首先希望提高ale 基因在E.coli內之表現，於 是設計寡核 酸導入新的基因起始碼子TTG 突變為ATG ，由此寡核 酸導入新的NdeI 限制 切割處，以助篩選突變基因。另外為了探討活性中心Asp 在突變成Asn 後是 否和subtilisin一樣無法maturation，亦藉著導入新限制 切割處，來篩選突變基因 。同樣的我們將活性中心Asp 突變成Glu ，希望檢討其對酵素性質之影響。最 後為了能訊速純化此酵素，我們將鹼性彈性蛋白 之Thr 改變成Cys ，可用簡 易SH-affinity 管柱純化之。以上四種突變已完成，今後希望研究此突變對其酵素之 表現以及活性有何影響。