Análisis funcional de genes reguladores del desarrollo floral de guisantes (Pisun sativum L.).

• Main Author: Berbel Tornero, Ana
• Other Authors: Madueño Albi, Paco
• Format: Doctoral Thesis
• Language: Spanish
• Published: Universitat de València 2002
• Subjects: Facultad de Biología; 58 - Botànica
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/9502; http://nbn-resolving.de/urn:isbn:8437061229

Con el fin de profundizar en la comprensión de los mecanismos moleculares que gobiernan los procesos de la iniciación y desarrollo floral de guisante nos planteamos los siguientes objetivos : PRIMERO.- Análisis funcional de los genes MADS de guisante PEAM1, PEAM4 y PEAM6 mediante dos tipos de abordajes, alternativos a la transformación de guisante: (i) analizando el fenotipo resultante de su expresión constitutiva en plantas silvestres de los sistemas heterólogos Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum y (ii) ensayando la capacidad de los genes PEAM4 y PEAM1 de complementar mutantes de Arabidopsis de clase A y B, respectivamente. SEGUNDO.- Utilizar la tecnología del doble híbrido en levaduras para: (i) identificar proteínas que interaccionan con los productos de los genes MADS PEAM4 y PEAM6 y (ii) testar la interacción entre las proteínas PEAM4 y PEAM6. Los resultados de la expresión constitutiva de PEAM1 en plantas silvestres de Arabidopsis y de tabaco apoyan la hipótesis de que PEAM1 funciona como un gen de identidad de órgano floral de tipo B. Además, el hecho de que la construcción 35S::PEAM1 sea capaz de complementar la mutación pi-1 de Arabidopsis, pero no las mutaciones ap3-1 o ap3-3, confirma que PEAM1 es el homólogo funcional de guisante del gen PI. La expresión constitutiva de PEAM4 acelera la floración en Arabidopsis y tabaco, induce la conversión de las inflorescencias en flores en Arabidopsis, y reduce el grado de ramificación de las inflorescencias de tabaco sugiriendo que PEAM4 podría estar implicado en el proceso de la iniciación floral de guisante; en tabaco además genera un fenotipo de floración inhibida que podría deberse a un silenciamiento en los ápices del tallo de los genes de tabaco NAP1-1 y NAP2-2, homólogos a PEAM4. PEAM4 es, además, capaz de restaurar los defectos florales del mutante ap1-1 de Arabidopsis. Todos estos datos indican que PEAM4 es el homólogo funcional de guisante del gen AP1 de Arabidopsis y que comparte tanto la capacidad de funcionar como un gen de identidad de meristemo floral como la de especificar la identidad de los órganos del periantio y actuando así como un gen de función A. La expresión constitutiva de PEAM6 acelera la floración en tabaco y Arabidopsis, y en esta última además provoca la conversión de las inflorescencias en flores. Esto concuerda con la hipótesis de que PEAM6 pueda estar implicado en el proceso de la iniciación floral de guisante, sugerida previamente a partir de las evidencias genéticas que correlacionan a este gen con la mutación veg1 de guisante, y por su expresión temprana en los meristemos florales. No obstante, el fenotipo resultante de la expresión constitutiva de PEAM6 también es compatible con un papel como gen de tipo SEP, con los que comparte homología de secuencia. Los datos disponibles sugieren que tal vez PEAM6 podría llevar a cabo una doble función en guisante, como gen de iniciación floral y como gen de identidad de órgano floral de tipo SEP. El resultado positivo del ensayo de interacción entre PEAM4 y PEAM6 en el sistema del doble híbrido en levadura, así como el hecho de que PEAM4 haya sido aislado repetidamente en el rastreo de una genoteca de cDNA de ápices florales de guisante, utilizando como cebo a PEAM6, muestran que estas dos proteínas poseen la capacidad de interaccionar. Por otra parte, la intensificación sinérgica del fenotipo de las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan constitutivamente, y de manera simultánea, PEAM4 y PEAM6 indica que estos dos genes interaccionan in planta durante la iniciación floral y apoya la hipótesis de la interacción entre sus productos génicos sugerida por los experimentos en levadura. === In an attempt to understand the molecular mechanisms that control the initiation and flower development processes in pea floral we aimed to achieve the following objectives: FIRST:-Functional analysis of the pea MADS genes PEAM1, PEAM4 y PEAM6 by two types of approaches, alternative to the pea transformation: (i) analyzing the resulting phenotype of the constitutive expression in wild type plants of heterologous systems Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum and (ii) testing the ability of the PEAM1 and PEAM4 genes to rescue the defects of Arabidopsis mutants. SECOND.- The use the two hybrid system in yeast in order to: (i) identify proteins that interact with products of the pea MADS genes PEAM4 y PEAM6 and (ii) assay the interaction between PEAM4 and PEAM6 proteins. The results of constitutive expression of PEAM1 in wild-type plants of Arabidopsis and tobacco, and the specific rescue of pi-1 mutation confirm that PEAM1 is the pea PI function homologue. Our results indicate that PEAM4 is the functional homologue to AP1 and SQUA that PEAM4, despite lacking a canonical CaaX-box, functions as a floral meristem identity gene in heterologous systems Arabidopsis and tobacco since accelerates flowering and besides induces inflorescence to flower conversion in Arabidopsis. Moreover, PEAM4 was able to restore perianth organ identity in the strong mutant ap1-1 of Arabidopsis suggesting that it could function as an A-class gene in pea. The constitutive expression of PEAM6 accelerates flowering in tabacco and Arabidopsis, and besides induces inflorescence to flower conversion in Arabidopsis. This agrees with the hypothesis that PEAM6 could be involved in floral initiation in pea previously suggested by genetic evidences that correlates this gene with pea veg1 mutation and by its early expression in floral meristems. But, the resulting phenotype of the constitutive expression also compatible with a role as SEP gene which share sequence homology; the data suggest that PEAM6 could carried out a double role in pea as a floral initiation and also organ identity gene. Finally, PEAM4 and PEAM6 interact in planta during floral initiation and their proteins interact in yeast in a two-hybrid assay.