Análisis integrado de morfología y movilidad espermática humana con el uso del sperm class analyzer

• Main Author: Álvarez Lleó, Cristina
• Other Authors: Soler Vázquez, Carles
• Format: Doctoral Thesis
• Language: Spanish
• Published: Universitat de València 2003
• Subjects: Biológicas; 57 - Biologia
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/9486; http://nbn-resolving.de/urn:isbn:8437057590

El uso de los sistemas computarizados de análisis seminal requiere su validación respecto de los métodos de uso generalizado de valoración referidos a los criterios de la OMS (1999). En este trabajo se pretende validar el uso del Sperm Class Analyzer® (V5.1) en el laboratorio clínico humano, así como abordar una análisis integrado de los diversos parámetros cinemáticos y morfométricos de los espermatozoides aportados por el sistema.En primer lugar, se trató de determinar las condiciones más adecuadas de adquisición de imágenes. Para ello, se utilizaron 9 muestras seminales con características heterogéneas. Un alícuota de cada una de las muestras se centrifugó con el fin de obtener plasma seminal con el que realizar diluciones homólogas (50%) y así evitar modificaciones en sus características físico-químicas que pudiesen afectar a los parámetros de movilidad. Los análisis se realizaron con el software del módulo de movilidad del analizador SCA®, a partir de semen fresco y diluido, con contraste de fases positivo y negativo, y con los objetivos de 10x y 20x.Se analizó la posible influencia de las variables metodológicas consideradas en el porcentaje de trayectorias erróneas, así como respecto de los parámetros cinemáticos (VCL, VSL, VAP, LIN, STR, WOB, ALH y BCF) entre sí. Por otra parte, se valoró la correlación entre las determinaciones subjetivas y las objetivas de la concentración y del porcentaje de móviles progresivos (a+b) y totales (a+b+c). El único parámetro que nos aportó la información necesaria para decantarnos por una de las condiciones de análisis fue el de las trayectorias erróneas. Para realizar el estudio cinemático global y de acuerdo con los resultados previos, se eligió como condición de trabajo: contraste de fases negativo, objetivo de 20x y muestra sin diluir. En primer lugar, se realizó un estudio previo de correlación entre la concentración subjetiva determinada con las cámaras Neubauer y Makler, observándose correlación altamente positiva. Seguidamente, se analizó la correlación entre las determinaciones subjetivas y las objetivas de concentración (con la cámara Neubauer), y porcentaje de móviles progresivos y totales (con la cámara Makler).A continuación, se hizo un estudio de correlación entre las diversas variables aportadas por el sistema SCA®. Tras lo cual, se analizó la correlación entre los parámetros cinemáticos, y las determinaciones objetivas de concentración y porcentaje de móviles progresivos y totales.Finalmente, se calcularon y analizaron las componentes principales, a partir de la reducción de las variables cinemáticas a una serie de factores que representaban la mayor parte de la varianza total. Se evaluó la matriz de componentes, calculada a partir de las variables y, después de la extracción inicial de dichas componentes, los factores ortogonales fueron rotados utilizando el criterio Varimax. La interpretación de los resultados se basó en el análisis de los factores dominantes y en el porcentaje de la varianza total explicativa. Las 8 variables cinemáticas quedaron reducidas a tres componentes principales: Índices (explicaba el 42,52 % del total de la varianza), Velocidades (36,74 %) y Frecuencia (12,67 %).Por otra parte, se realizó un estudio morfométrico en paralelo. De cada muestra se realizaron frotis que se tiñeron con el kit Hemacolor, analizándose con el módulo de morfometría del SCA® un mínimo de 100 células por muestra.En primer lugar, se analizó la correlación entre las determinaciones subjetivas y las objetivas (formas normales, defecto de cabeza, defecto de pieza intermedia, y defecto de cabeza + pieza intermedia); y posteriormente, se estudió la correlación entre las diversas variables morfométricas aportadas por el sistema SCA®. A continuación, se hizo un análisis de correlación entre parámetros morfométricos, y determinaciones objetivas de concentración y porcentaje de móviles progresivos y totales.Por último, se procedió a la reducción de los parámetros morfométricos a sus componentes principales. Un total de 13 variables morfométricas (cinco de tamaño de la cabeza: área, perímetro, longitud, anchura y porcentaje de acrosoma; cuatro de forma de la cabeza: elipticidad, rugosidad, elongación y regularidad; dos de tamaño de la pieza intermedia: anchura y área, y dos de inserción: la distancia y ángulo entre los ejes mayores de la cabeza-pieza intermedia), quedaron reducidas a tres componentes que explicaban la mayor parte de la varianza total: Forma de la cabeza (explicaba el 37,91 % de la varianza), Tamaño de la cabeza (26,57 %) y Pieza Intermedia (18,64 %).Finalmente, se integraron los parámetros cinemáticos y morfométricos, se estudió su correlación, y se redujeron a sus componentes principales (CP) mediante el programa SPSS. Estas componentes explicaban el 83, 19% del total de la varianza; CP1, Forma de la cabeza (explicación de la varianza del 29,65%); CP2, Tamaño de la cabeza (20,57%); CP3, Índice de velocidad (13,71%); CP4, Velocidades (12,44%) y CP5, Pieza intermedia (6,78%). Con lo visto hasta ahora, el uso del SCA® se puede considerar validado, en el contexto del laboratorio clínico humano, para el análisis automático de la movilidad y morfología espermática en las condiciones utilizadas; además, se pone de manifiesto la importancia de los parámetros en la definición de la cinemática y morfometría espermática por lo que su inclusión en el análisis resulta imprescindible; y finalmente la reducción del conjunto de parámetros aportados por el SCA® a cinco componentes principales permite sintetizarlos, abriendo las puertas a una comprensión integrada de las características espermáticas, introduciendo criterios mucho más robustos en la valoración seminal que la valoración individualizada de dichos parámetros.Para valorar si los criterios diagnósticos actuales eran deducibles a partir de las nuevas variables obtenidas, las 56 muestras seminales se clasificaron siguiendo los criterios diagnósticos de la OMS (1992, 1999). Como resultado de esta clasificación, se obtuvieron 5 grupos de diagnósticos: normospérmicos, teratospérmicos, oligospérmicos, teratoastenospérmicos y teratoastenooligospérmicos. Se compararon los parámetros cinemáticos y morfométricos, así como las componentes principales entre los grupos, no observándose concordancia entre los criterios diagnósticos actuales y los parámetros cuantitativos.Concluyéndose que los criterios diagnósticos seguidos hasta ahora por la OMS no se ajustan a la valoración cuantitativa de la que ahora se dispone. Por ello, el significado real del presente estudio sólo se tendrá cuando se comience a aplicar el conjunto de conocimientos aquí desarrollados en el campo de la clínica, lo que puede conducir en un futuro, al menos así lo esperamos, a la definición de nuevos parámetros diagnósticos más potentes y precisos. === The aim of this work was validated the use of Sperm Class Analyzer® (SCA) in the human clinic laboratory, so to start on a integrated analysis of the cinematic and morphometric parameteres of spermatozoa. Previously, the suitable conditions of image acquisition were determined. Analysis were made with diluted and no diluted semen, positive and negative contrast, and 10x and 20x objetive (9 samples). The best work condition was no diluted semen, negative contrast and 20x objetive.Firstly, manual sperm counting was compared between Makler chamber and Neubauer hemocytometer (56 samples), showing high correlation. Beside, subjetive and objetive determinations were correlated, so cinematic parameters (VSL, VAP, WOP, LIN, STR, ALH and BCF) among them.Finally, principal components were calculated and analyzed. The understanding of results was based in the dominat factors so in the rate of explicative total variance. Eigth parameters were reduced to three principal components.On another hand, a morphometric study was parallel realized. Equally, subjetive and objetive determinations were correlated, so different morphometric parameters (lenght, width, area, perimeter, acrosome rate, Ellipticity, Rugosity, Elongation and Regularity of head; width and area of middle-piece; and distance between larger axises of head and middle-piece) among them.Lastly, principal components were calculated and analyzed. Thirteen morphometric parameters were reduced to three principal component.To finish, cinematic and morphometric parameters were integrated, studing their correlation and reducing the total of variables to five principal components: shape of head, size of head, index, velocity and middle-piece. In conclusion, the use of SCA is valited to spermatic motility and morphology analysis and the reduction to principal components introduces stearier criterion in seminal assessment.Finally, to assess if actual diagnostic criterions were deducible of new obtained variables, seminal samples were classified according to the WHO guidelines (1992, 1999). Five diagnostic groups were obtained. Cinematics and morphometrics parameters and principal components were compared between the groups, no showing correlation between actual diagnostic criterion and cuantitative parameters. Therefore, the definition of new diagnostic parameters more precise is necessary.