| Summary: | The human M3 muscarinic acetylcholine receptor (M3R) regulates many important physiological roles in the central and peripheral nervous systems, and it is involved in the pathophysiology of several neurodegenerative and autoimmune diseases, representing attractive potential pharmacological target for intervention. However, the lack of structural information on this receptor hampered the development of new potent antagonist with increased selectivity and lower side effects. Such structural information can be only achieved by means of experimental biophysical techniques, which require large quantities of pure receptor. Considering that under physiological conditions the expression of G-protein coupled receptors (GPCRs) is relatively low, optimization of the receptor overexpression is a pre-requisite for structural studies efforts to be performed. In addition, although is has well established that GPCR undergo post-translational and increase evidences support that these are tight links to receptor roles, little progress has been made in the post-translational modifications field in some GPCRs, such as the case of M3R.
In this study, we provide some strategies to improve muscarinic receptor heterologous expression in mammalian cells guaranteeing proper post-translational modifications. In addition, we have been able to extract high levels of functional receptor from COS-7 cells using a detergent combination tested, and to purify the receptor to near homogeneity-keeping the full wild type receptor properties- by means of different affinity purification methods. Regarding the post-translational modifications studied, our findings provide the first evidence of the critical role that N-glycan chains play in determining muscarinic receptor distribution and localization, as well as in cell integrity. Furthermore, our data reveal a role for palmitoylation in determining M3R residence within lipid raft, as well as in receptor internalization and down-regulation === El receptor muscarínico de acetilcolina subtipo M3 humano (M3R) regula importantes funciones en el sistema nervioso central y periférico, y está implicado en la fisiopatología de varias enfermedades neurodegenerativas y autoinmunes, lo que representa una atractiva diana terapéutica para la intervención farmacológica. Sin embargo, la falta de la información estructural sobre este receptor obstaculizado el desarrollo de nuevos y potente fármacos de gran selectividad y bajo efecto secundario. Tal información estructural, puede lograrse por medio de la experimentación con técnicas biofísicas que requieren grandes cantidades de receptor puro. Teniendo en cuenta que en condiciones fisiológicas la expresión de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) es baja, la sobreproducción del receptor es un pre-requisito para que los estudios estructurales puedan ser realizados. Además, aunque se ha establecido que los GPCR sufren modificaciones post-translationales y que en los últimos años un significante número de reportes sugieren que estas modificaciones están estrechamente vinculadas a las funciones del receptor, poco se ha avanzado en el estudio de estas modificaciones en el campo de algunos GPCRs, como es el caso de M3R. En este estudio, nosotros describimos algunas estrategias para mejorar la expresión de los receptores muscarínicos en células de mamíferos garantizando unas correctas modificaciones post-translacionales. Además, hemos sido capaces de extraer altos niveles de receptor funcional a partir de células COS-7 con una combinación de detergentes, purificamos el receptor M3R cerca de la homogeneidad, mantenimiento de la totalidad de las propiedades biológicas encontradas en el receptor silvestre. En relación a las modificaciones post-translationales estudiadas, nuestros resultados proporcionan la primera evidencia del papel crítico de las cadenas de N-glicanos en la determinación de la localización de estos receptores, así como en la integridad celular. Además, nuestros datos revelan un importante papel de las modificaciones lipídicas de M3R en relación a la distribución del receptor en microdominios resistente a detergentes, así como en la regulación del receptor. En resumen, las estrategias utilizadas pueden contribuir al incremento de la expresión M3R. De esta forma los esfuerzos para la purificación del receptor a gran escala pueden ser iniciados. Para ellos, nosotros revelamos una posible estrategia. Además, proponemos los posibles sitios de N-glicosilación y S-acilación en el M3R expresado en células COS-7, y proporcionamos evidencias experimentales que avalan la implicación funcional de estas modificaciones en el papel del receptor.
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