Efecte de la urèmia en el metabolisme de la vitamina D: implicacions en la calcificació vascular

• Main Author: Torremadé Pascual, Noèlia
• Other Authors: Valdivielso Revilla, José Manuel
• Format: Doctoral Thesis
• Language: Catalan
• Published: Universitat de Lleida 2013
• Subjects: Bioquímica i Biologia Molecular; 57 - Biologia
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/131162

La calcificació vascular és una complicació de la malaltia renal crònica i una de les principals causes de l’augment de morbiditat i mortalitat en els pacients. Aquests pacients presenten una disminució en els nivells de vitamina D (1,25(OH)2D3) i desenvolupen hiperparatiroïdisme secundari. Per aquest motiu, pacients amb MRC són tractats amb calcitriol o altres anàlegs. La 25-hidroxivitaminaD també s'utilitza, però sense cap coneixement de la seva eficàcia i toxicitat. Les recomanacions actuals indiquen que s’ha de suplementar amb 25D per assolir un llindar determinat que pugui afectar les accions clàssiques i no clàssiques de la vitamina D en l'organisme. No obstant això, l’ incidència directa en l'homeòstasi del calci (sense convertir-lo en calcitriol) no s’entèn. En el present treball, s’ha determinat l'efecte de la urèmia en la regulació de gens del metabolisme de la vitamina D i el paper de la síntesi local de calcitriol en la urèmia sobre la calcificació vascular utilitzant els ratolins KO per la 1αhidroxilasa. També, hem estudiat l'eficàcia i la seguretat del tractament amb 25D en el metabolisme mineral en un model de reducció del 75% de la massa renal en ratolins que no tenen la 1αhidroxilasa i el seu possible efecte toxic en ratolins wild-type. Resultats inicials en rates mostren que la urèmia desregula l’expressió de proteïnes implicades en el metabolisme de la vitamina D en cèl•lules de múscul llis vascular (VSMC), augmentant l'expressió de la 1αhidroxilasa. Aquesta regulació és específica de teixit i és diferent en el ronyó. Ratolins wild-type amb un model de MRC tractats amb altes dosis diàries de calcitriol (400ng/Kg) durant dues setmanes mostren una pèrdua de pes significativa, mentre que els 1αKO no perden pes. Nivells sèrics de calci, fòsfor, BUN i 1,25D augmenten i són similar en els dos grups tractats. D'altra banda, els nivells de PTH disminueixen en ambdòs grups per sota dels valors normals. La calcificació vascular augmenta de forma significativa en els ratolins WT en comparació amb ratolins 1αKO. Resultats similars s'observen amb tinció de vermell d’alizarina i l’immunohistoquímica de Runx2, que augmenta només en ratolins WT. In vitro, les CMLV WT tractades amb sèrum urèmic també mostren un augment significatiu de la calcificació i del runx2, que no s'observa en les cèl·lules 1αKO. Quan les CMLV de rata s’obrexpressen la 1αhidroxialsa també calcifiquen més en comparació amb les cèl•lules control. Aquests resultats indiquen que la 1αhidroxilasa actuaria com a mediador de la calcificació vascular en la urèmia incrementant la síntesis local de 1,25(OH)2D3. Fet que és d’especial interès en els pacients amb malaltia renal que són tractats amb 25OHD3. Per a estudiar l'efecte de la 25D, es va realitzar un estudi dosi-respostaen ratolins 1αKO nefrectomitzats amb 25, 50 i 100 ng/g de 25(OH)D3 per comparar-ho amb una dosi única de 1,25(OH)2D3 (50pg/g). L’administració de 25(OH)D3 pot normalitzar el Ca, P i PTH en sèrum amb una potència semblant a la de la 1,25D en un model de ratolí 1αKO amb MRC, un ratolí incapaç d’activar la 25D a 1,25D. Confirmant una unió directa i activació del VDR per la 25D. La 25D també pot activar el VDR per imitar la 1,25D en la up-regulació de gens i proteïnes que medien el transport transcellular de calci en el ronyó (TRPV5, Calbindin-D28k, PMCA1b) i en el duodè (TRPV6, Calbindin D9k i PMCA1b) en els 1αKO nefrectomitzats. Les dosis de 25D necessàries per imitar la 1,25D en la correcció de les anomalies en el transport de calci transcel·lular a nivell renal i duodenal causen un augment en els nivells de 25D en sèrum per sobre dels nivells recomanats en pacients amb MRC. La calcificació vascular que s'observa en ratolins WT mostra un efecte tòxic del tractament. També, hem observat que la 25D és capaç d'activar la 24hidroxilasa i el VDR en CMLV, mostrant la capacitat de la 25D d’activar directament el VDR a l'artèria. En conclusió, tots aquests resultats suggereixen que la producció local de calcitriol per la 1αhidroxilasa en l'artèria mediaria la calcificació vascular observada en la urèmia. Resultats que indiquen que els tractaments amb 25D en pacients amb MRC han de fer-se de forma controlada tant pel seu efecte directe activant el VDR com a causa de l’increment de la 1αhidroxilasa en la urèmia la qual afavoriria la seva transformació a 1,25(OH)2D3 produint toxicitat. === La calcificación vascular es una complicación de la enfermedad renal crónica y una de las principales causas del aumento en la morbilidad y mortalidad en los pacientes. Estos pacientes presentan una disminución en los niveles de vitamina D (1,25(OH)2D3) y desarrollan hiperparatiroidismo secundario. Por esta razón, los pacientes con ERC son tratados con calcitriol u otros análogos. También se utiliza la 25-hidroxivitamina D, pero sin ningún conocimiento de su eficacia y toxicidad. Las recomendaciones actuales sugieren que se complemente con 25D para alcanzar un cierto umbral que pueda afectar las acciones clásicas y no clásicas de la vitamina D. Sin embargo, el impacto directo en la homeostasis del calcio (sin convertirlo en calcitriol) no se conoce. En el presente estudio, se determinó el efecto de la uremia en la regulación de genes del metabolismo de la vitamina D y el papel de la síntesis local del calcitriol en la uremia y su efecto sobre la calcificación vascular utilizando ratones KO para la 1αhidroxilasa. También, se estudió la eficacia y la seguridad del tratamiento con 25D en el metabolismo mineral en ratones que carecen de la 1αhidroxilasa con una reducción del 75% de la masa renal y el efecto en ratones WT de la dosis efectiva para reducir los niveles de PTH en ratones KO. Los primeros resultados en ratas demuestran que en la uremia se desregula la expresión de las proteínas implicadas en el metabolismo de la vitamina D en las células musculares lisas vasculares (CMLV), aumentando la expresión de la 1αhidroxilasa. Esta regulación es específica del tejido y es diferente de la del riñón. Los ratones wild type con un modelo de ERC tratados con dosis elevadas de calcitriol (400ng/Kg) muestran una pérdida significativa de peso, mientras que los 1αKO no pierden peso. Los niveles séricos de calcio, fósforo, BUN y 1,25D suben y son similares en los dos grupos. Por otro lado, los niveles de PTH caen por debajo de los valores normales en ambos grupos. La calcificación vascular aumenta significativamente en los ratones WT en comparación con los 1αKO. Resultados similares fueron observados con la tinción rojo de alizarina y la immunohistoquímica de Runx2, aumentando sólo en los ratones WT. In vitro, las CMLV WT tratadas con suero urémico también muestran un aumento significativo de la calcificación y de la expresión de runx2, que no se observa en las células 1αKO. Cuando las CMLV de rata sobrexpresan la 1αhidroxilasa calcifican más en comparación con las células control. Estos resultados indican que la 1αhidroxilasa actuaria como mediador de la calcificación vascular en la uremia incrementando la síntesis local de la 1,25(OH)2D3. Hecho que es de especial interés en los pacientes con enfermedad renal tratados con 25OHD3. Para estudiar el efecto de la 25D, se realizó un estudio de dosis-respuesta con ratones 1αKO nefrectomizados y tratados con 25, 50 y 100 ng/g de 25(OH)D3 y se compararon con una sola dosis de 1,25(OH)2D3 (50pg/g). La administración de 25(OH)D3 puede normalizar el Ca, P y PTH en suero con una potencia similar a la del 1,25D en un modelo de ratón 1αKO con ERC. Confirmando un efecto directo y activador de la 25D sobre el VDR. La 25D también puede activar el VDR para imitar la 1,25D en la regulación de genes y proteínas que median el transporte transcelular de calcio en el riñón (Calbindin-D28k, TRPV5, PMCA1b) y en el duodeno (Calbindin D9k y TRPV6, PMCA1b) en ratones 1αKO nefrectomizados. Las dosis de 25D necesarias para imitar la 1,25D en la corrección de las alteraciones en el transporte de calcio transcelular a nivel renal i duodenal producen un aumento en los niveles de 25D en el suero por encima de los niveles recomendados en pacientes con ERC. Además, esta dosis causa calcificación vascular en ratones WT. También hemos observado que la 25D es capaz de activar la 24hidroxilasa i el VDR en las CMLV, mostrando la capacidad de la 25D de activar de forma directa el VDR en la arteria. En conclusión, estos resultados sugieren que la producción local de calcitriol por la 1αhidroxilasa en la arteria mediaría la calcificación vascular observada en la uremia. Además los tratamientos con 25D en pacientes con ERC deben hacerse de forma muy controlada === Vascular calcification is a complication of chronic kidney disease and one of the main predictors of increased morbidity and mortality in patients. These patients present a decrease in vitamin D levels (1,25(OH)2D3) leading to secondary hyperparathyroidism. For these reasons CKD patients are usually treated with calcitriol or other analogues. 25-hydroxyvitaminD is also used without any knowledge of its efficacy and toxicity. Current recommendations are to supplement with 25D to achieve a certain threshold that could affect both, classical and nonclassical actions of vitamin D in the body. However, its direct effect on calcium homeostasis (without conversion in calcitriol) is not fully understood. In the present work, we determined the effect of uremia in the regulation of vitamin D metabolism genes, and the role of the local synthesis of calcitriol on uremia-induced vascular calcification using 1αhidroxilaseKO mice. Also, we studied the efficacy and safety of 25D treatment on mineral metabolism in a model of 75% nephron mass reduction in mice lacking 1αhidroxilase and the effect in WT mice of the dose found to be effective reducing PTH levels in KO mice. Initial results in rats show that uremia deregulates proteins involved in vitamin D metabolism in vascular smooth muscle cells (VSMC), increasing the expression of 1αhydroxylase. This regulation is tissue specific and is different from the one in the kidney. Wild type mice with a CKD model treated with high daily doses of calcitriol (400ng/Kg) for two weeks show a significant weight loss, while 1αKO do not lose weight. Serum calcium levels, phosphorus, BUN, and 1,25D increase and are similar in both calcitriol-treated groups. Furthermore, PTH levels decrease in both groups below normal values. Vascular calcium content significantly increased in the WT mice compared to 1αKO mice. Similar results are observed with alizarin red staining and immunohistochemical detection of Runx2, which increase only in WT mice. In vitro, WT VSMC treated with uremic serum also show a significant increase in calcification and runx2 expression that is not observed in 1αKO cells. When VSMC from rat overexpressed 1αhydroxyalse also calcify more compared with the control cells. These results show that 1αhidroxilase acts as a mediatior of vascular calcificaton in uremia, increasing local synthesis of 1,25(OH)2D3. This fact is important in patients with renal disease treated with 25OHD3. To study the effect of 25D, a dose response study was carried out in 1αKO nephrectomized using 25, 50 and 100 ng/g of 25(OH)D3 to compare with a single dose of 1,25(OH)2D3 (50pg/g). 25(OH)D3 administration can normalize serum Ca, P, and PTH with a potency similar to that of 1,25D in the 1αKO mouse model of CKD, confirming a direct binding and activation of the VDR by 25D. Also, 25D can activate the VDR to mimic 1,25D in the up-regulation of genes and proteins mediating transcellular calcium transport in the kidney (TRPV5, Calbindin-D28k, PMCA1b) and in the duodenum (TRPV6, Calbindin-D9k, and PMCA1b) in the nephrectomized 1αKO. The doses of 25D required to mimic 1,25D in correcting the abnormalities in renal and duodenal transcellular calcium transport cause elevation in serum 25D levels far beyond the recommended levels in CKD patients. Furthermore this dose causes vascular calcification in WT mice. Also, we observed that 25D is able to activate 24hydroxylase and VDR in VSMC, showing the capacity of 25D to direct activate VDR in the artery. In conclusion, all these results suggest that local production of calcitriol by 1αhydroxylase in the artery may mediate vascular calcification observed in uremia. Furthermore, 25D treatments in patients with CKD should be done in a very controlled manner.