Caracterización de una nueva estructura citoplásmica en la bacteria Antártica Pseudomonas deceptionensis M1T mediante (Crio-) Microscopía Electrónica de Transmisión: Tomografía y Reconstrucción Tridimensional

• Main Author: Delgado Valderrama, Lidia
• Other Authors: Mercadé Gil, M. Elena
• Format: Doctoral Thesis
• Language: Spanish
• Published: Universitat de Barcelona 2015
• Subjects: Ciències de la Salut; 579 - Microbiologia
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/285808

Tesi realitzada als Centres Científics i Tecnologògics (CCIT-UB) === La Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) combinada con la Tomografía Electrónica (ET) ha proporcionado una visión más precisa de la complejidad de la estructura de las células procariotas. A su vez, la crioinmovilización de muestras por enfriamiento rápido permite la observación de muestras biológicas en un estado cercano al natural, mejorando la caracterización de estructuras bacterianas conocidas y permitiendo el descubrimiento de nuevas. La crioinmovilización por alta presión (HPF) seguida de criosustitución (FS) e inclusión en resina de la bacteria Antártica Pseudomonas deceptionensis M1T permitió observar una estructura nueva que no se correspondía con ningún tipo de inclusión o estructura descrita previamente como componente del citoplasma bacteriano. Ésta, se observaba frecuentemente al cultivar la bacteria en condiciones de crecimiento lento a bajas temperaturas (medio TSA, 0ºC, 12 días). La aplicación de la ET a temperatura ambiente (RT-ET) demostró que la nueva estructura estaba constituida por un número variable de discos ovalados, planos, apilados, de tamaño variable, grosor constante, rodeados aparentemente por una membrana y próximos a la membrana plasmática (PM) bacteriana. Debido a esta apariencia de discos apilados, esta nueva estructura se denominó “Stack”. Las células que los presentaban, podían contener uno o varios simultáneamente, en cuyo caso se observaban aislados o agrupados en una misma localización, difiriendo en sus orientaciones. La visualización de los “Stacks” mediante diferentes técnicas de (Cryo-)TEM: Tokuyasu, criofractura, secciones vítreas y bacteria entera crioinmovilizada por Plunge freezing (PF), corroboró su existencia y descartó un origen artefactual. La Criotomografía electrónica (CET) de bacterias completas crioinmovilizadas por PF permitió el estudio de la distribución espacial de los “Stacks” en el contexto celular, confirmando su estructura tridimensional formada por discos ovalados planos, su presencia aislada o agrupada, y su ubicación periférica en el citoplasma bacteriano, coincidiendo con los resultados obtenidos por RT-ET. No se observó continuidad entre la membrana que rodeaba las subunidades de los “Stacks” y la PM, por lo que no parecen ser invaginaciones de la misma. Asimismo, la CET de secciones vítreas (CETOVIS) demostró que la membrana que rodeaba los discos del “Stack” presentaba el perfil de bicapa lipídica. El estudio comparativo del grosor de la membrana de estas subunidades y del de la PM, tanto en bacteria completa como en secciones vítreas, mostró diferencias significativas, apuntando a una composición diferente entre ambas. Los “Stacks” se detectaron en otras especies del género Pseudomonas cultivadas en condiciones de crecimiento lento a bajas temperaturas. En todos los casos estudiados, los “Stacks” se encontraron muy próximos a microfibras de DNA, apareciendo parcial o totalmente envueltos por el nucleoide bacteriano. El estudio de la correlación entre el número de “Stacks” y del número de bacterias en fase de septación, cuantificado en secciones de resina de P. deceptionensis M1T cultivadas en TSA a 0ºC a diferentes tiempos, apuntó también a una posible relación entre la presencia de “Stacks” y alguna fase de la dinámica del cromosoma bacteriano. === In recent years, improvements in transmission electron microscopy (TEM) and tomography have provided a more accurate view of the complexity of the structure of prokaryotic cells. This fact has allowed the study of biological samples in a close-to-native state, enabling us to refine our knowledge of already known bacterial structures and to discover new ones. Application of these techniques to the new Antarctic cold-adapted bacterium Pseudomonas deceptionensis M1T has demonstrated the existence of a previously undescribed cytoplasmic structure that does not correspond to known bacterial structures and which we called “Stack”. This structure was mainly visualized in slow growing cultures of P. deceptionensis M1T and can be described as a set of stacked discs surrounded by a membrane-like structure, located close to the cell membrane, but not continuous with it, and found in variable number. Stacks were mostly observed very close to DNA fibers. Stacks are not exclusive to P. deceptionensis M1T and were also visualized in slow-growing cultures of other bacteria. Cryo-electron microscopy (Cryo-EM) and CET of frozen-hydrated P. deceptionensis M1T cells confirmed that stacks were found at different locations within the cell cytoplasm, in variable number, separately or grouped together, very close to the plasma membrane (PM), and thus establishing that they were not artifacts of the previous sample preparation methods. CET of plunge-frozen whole bacteria and vitreous sections verified that each stack consisted of a pile of oval disc-like subunits, each disc being surrounded by a lipid bilayer membrane. Stacks did not appear to be invaginations of the PM because no continuity between both membranes was visible when whole bacteria were analyzed. We are still far from deciphering the function of these new structures, but a first experimental attempt links the stacks with a given phase of the cell replication process.