Detecció i anàlisi de la persistència de les bifidobactèries en aigües per a la determinació de l'origen de la contaminació fecal mitjançant tècniques de cultiu i mètodes moleculars qualitatius i quantitatius

• Main Author: Bonjoch Fornos, Xavier
• Other Authors: Blanch i Gisbert, Anicet
• Format: Doctoral Thesis
• Language: Catalan
• Published: Universitat de Barcelona 2005
• Subjects: Aigües residuals; Contaminació fecal; Indicadors microbians; Bacteriologia; Ciències Experimentals i Matemàtiques; 579
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/2395; http://nbn-resolving.de/urn:isbn:8468933902

El gènere Bifidobacterium adquireix una gran importància com a microorganisme indicador de contaminació fecal. És un dels gèneres predominants en la microbiota intestinal humana i d'alguns animals de sang calenta arribant a unes concentracions entre 109 i 1010 cèl·lules/g de femta. La fisiologia anaeròbia, els requeriments nutricionals complexes i la seva incapacitat de multiplicar-se per sota dels 30ºC, fan que Bifidobacterium no pugi replicar-se a nivell extraentèric.L'objectiu d'aquesta tesi ha estat la optimització de les tècniques presents per a la detecció de Bifidobacterium spp. en mostres d'aigua residual per a la possible utilització de certes espècies d'aquest gènere bacterià com a indicadores de la contaminació fecal i determinar l'origen d'aquesta:1. Avaluar l'enumeració de Bifidobacterium spp. en tres medis selectius diferents, i comparar les diferents poblacions bacterianes de Bifidobacterium analitzades amb altres indicadors microbians en aigües.2. Definir proporcions entre les diferents poblacions d'indicadors i les bifidobactèries que permetin diferenciar l'origen humà o animal de la contaminació fecal en aigües.3. Determinar quines espècies de Bifidobacterium que s'han associat prèviament com exclusives dels humans, es troben només en aigües residuals urbanes. 4. Desenvolupar una tècnica molecular per a la detecció de les espècies de Bifidobacterium associades exclusivament a aigües residuals d'origen humà.5. Analitzar l'ús combinat d'aquest nou mètode molecular amb la proporció de les bifidobactèries fermentadores de sorbitol i de les bifidobactèries totals en el medi selectiu HBSA.6. Desenvolupar una PCR quantitativa en temps real per a la detecció de les espècies B. adolescentis i B. dentium. 7. Comparar les dues tècniques moleculars desenvolupades, PCR múltiple ADO-DEN i PCR quantitativa en temps real en aigües residuals d'origen humà.8. Comparar la persistència de les poblacions indicadores de la contaminació fecal en aigües juntament amb el gènere Bifidobacterium en aigua de riu.Els medis selectius analitzats per a Bifidobacterium, Beerens, HBSA i BFM, van presentar unes enumeracions molt similars en aigües residuals, proporcionant una elevada especificitat per a les bifidobactèries. No obstant, el medi Beerens i HBSA van recuperar un nombre significativament igual i més elevat de bifidobactèries cultivables. La hibridació colonial amb la sonda Bif permet una confirmació pràctica de les enumeracions, donant una correcció de la fracció de creixement no específic que donen el medis utilitzats.La proporció de les colònies de Bifidobacterium fermentadores de sorbitol respecte el nombre de colònies totals crescudes en el medi HBSA és una eina eficaç per a la determinació de l'origen de la contaminació fecal. Les espècies B. adolescentis i B. dentium van presentar una elevada especificitat per a les aigües d'origen humà, tot i que no es pot descartar la presència de B. adolescentis en alguna espècie d'aviram.El desenvolupament de la PCR múltiple ADO-DEN per a les espècies B. adolescentis i B. dentium és una eina molecular complementària per a caracteritzar l'origen de la contaminació fecal en aigües. Presenta un llindar de detecció 103 UCF/100mL.Les PCRs quantitatives específiques desenvolupades permeten la quantificació de les espècies B. adolescentis i B. dentium proposades com a indicadores de la contaminació fecal humana en aigües residuals d'origen humà. Aquesta tècnica presenta un llindar de detecció més alt que la de la PCR múltiple ADO-DEN essent de 104 UCF/100mL. Hi ha una diferencia significativa (P<0,05) en les inactivacions de totes les poblacions bacterianes a l'estiu respecte les inactivacions a l'hivern on són més baixes. El gènere Bifidobacterium és potencialment un bon indicador de l'origen de la contaminació fecal recent en aigües. La seva baixa persistència en l'entorn fa però menys operatiu el seu ús quan la contaminació fecal és remota en el temps. === The genus "Bifidobacterium" is proposed as indicators to identify the source of fecal pollution, since certain "Bifidobacterium" spp. are found only in humans, since it is abundant in the intestinal microbiota of humans and other warm-blooded animals. These organisms could be used to distinguish between human and animal pollution. They are found at a concentration of between 109 and 1010 cells/g in feces. Additionally, their anaerobic physiology, complex nutritional requirements and inability to multiply below 30ºC mean that they are unlikely to reproduce in extraenteric environments.The objective of this thesis has been the optimization of the techniques presents for the detection of "Bifidobacterium" spp. in samples of residual water. The selective media analyzed for "Bifidobacterium", Beerens, HBSA and BFM, they presented some very similar enumerations in residual water, provided a high specificity for the detection of bifidobacteria. Nevertheless, the enumeration of bifidobacteria was evaluated using three selective media. Beerens and HBSA media showed similar recoveries, with no statistically significant difference and BFM showed statistically different recovery for Bifidobacterium than the recovery on Beerens and HBSA media.The confirmation by colony hybridization of colonies of "Bifidobacterium" grown on the selective media revealed that some colonies belong to anaerobic bacterial genera other than bifidobacteria. The HBSA medium allows the calculation of the ratio Y/T that showed to distinguish fecal pollution origin. Values of this ratio higher than 0.20 indicate human origin. Values below 0.20 indicate animal origin. These results support previous studies postulating the use of sorbitol-fermenting bifidobacteria as human fecal indicators in sewageIn this study a multiple PCR for "B. adolescentis" and "B. dentium" species was developed to be used as a complementary molecular tool to characterize the origin of the fecal contamination in water. The threshold of this technique is 103 CFU/100mL. In order to quantify both species a quantitative PCR for "B. adolescentis" and "B. dentium" (proposed as indicators for human fecal contamination in residual water of human origin) was developed. This technique presents a threshold higher than the PCR multiple ADO-DEN being of 104 UCF/100mL. The genus "Bifidobacterium" is potentially a good indicator of the origin of the recent fecal contamination in water. But its low persistence in the environmental waters is a handicap when the fecal pollution is not recent.