Producció d'un inhibidor del VIH-1 en plantes de tabac i d'arròs

• Main Author: Castellet Llerena, Marc
• Other Authors: Ludevid Múgica, Maria Dolors
• Format: Doctoral Thesis
• Language: Catalan
• Published: Universitat de Barcelona 2006
• Subjects: Biogenètica; Recerca biomèdica; Proteòmica; Genòmica; Biotecnologia; Ciències de la Salut; 575
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/1052; http://nbn-resolving.de/urn:isbn:9788469000028

La expressió en plantes transgèniques representa una alternativa interessant per a la producció de proteïnes d'interès terapèutic. Els baixos costos de producció a gran escala, la capacitat de modificació postraduccional dels vegetals y la seguretat biològica del producte final son alguns del atractius d'aquest emergent sistema de producció.El T-20 es un nou fàrmac antiviral contra el VIH-1 que actua inhibint el procés d'entrada del virus dins la cèl·lula diana impedint que les membranes del virus i cèl·lula es fusionin. Actualment, la producció d'aquest pèptid de 36 aminoàcids es realitza per síntesis química en un procés extraordinàriament complex que condiciona el elevat preu del producte final.En aquest treball s'ha adoptat una estratègia per acumular el T-20 a plantes consistent en la seva expressió mitjançant una fusió amb diferents dominis rics en prolina de gamma-zeïna, proteïna de reserva de 27 kDa del blat de moro. Anteriors estudis han demostrat que aquests dominis tenen la capacitat de quedar retinguts dins el reticle endoplàsmic y induir la formació de cossos proteics en plantes transgèniques de tabac.S'ha utilitzat dos espècies vegetals, tabac i arròs, per tal de testar el nivell d'acumulació del T-20 en fusió en diferents teixits. En plantes de tabac s'ha escollit una expressió constitutiva mitjançant el promotor 35S per acumular a fulla el T-20 fusionat amb quatre seqüències riques en prolina diferents (Rx3, R3, P4 i X10), Els resultats han demostrat que, tant per transformació estable com transitòria, la fusió Rx3-T20, que conté tota la regió N-terminal de la gamma-zeïna, és la que s'acumula millor en fulles de tabac. A demés, en una línia transgènica s'ha comprovat que aquesta proteïna de fusió no només es estable enfront la dessecació de la fulla, sinó que la seva expressió s'activa durant aquest procés degut segurament al lloc d'inserció dins el genoma de la planta. També s'han obtingut línies transgèniques d'arròs per tal d'acumular el T-20 específicament a gra, beneficiant d'aquesta forma l'estabilitat y emmagatzemament del fàrmac. Després de comprovar que el promotor de la gamma-zeïna era actiu però no específic en plantes transgèniques d'arròs, es va optar per la utilització d'un promotor endogen, RP5, per tal d'expressar la proteïna de fusió Rx3-T20 específicament a gra d'arròs. Es van assolir alts nivells d'acumulació específica a gra, comparables amb els generats amb un promotor constitutiu 35S.Tant a tabac com a arròs es van portar a terme experiments de fraccionament subcel·lular mitjançant gradients de sacarosa que van mostrar que les proteïnes de fusió s'acumulaven en una fracció densa on sedimenten els cossos proteics de blat de moro. A demés, mitjançant inmunolocalització al microscopi confocal s'ha pogut visualitzar l'acumulació de la proteïna de fusió Rx3-T20 en fulles de tabac en unes estructures esfèriques compatibles amb cossos proteics. En arròs, la localització sota el microscopi electrònic ens ha demostrar l'acumulació d'aquesta proteïna dins els cossos proteics de tipus I naturals de l'arròs.Amb l'objectiu de demostrar que el sistema l'expressió en plantes permetia obtenir el fàrmac T-20 actiu es va desenvolupar un procés de purificació a partir de fulles de tabac consistent en una precipitació amb sulfat d'amoni, cromatografia de bescanvi aniònic, digestió amb proteasa y purificació per HPLC. Es va demostrar que el producte final corresponia per espectrometria de masses al T-20 y que, mitjançant experiments en cultiu cel·lular, presentava la mateixa activitat antiviral que el T-20 produït per síntesis química. D'aquesta manera es conclou que l'expressió en plantes transgèniques representa un sistema de producció de T-20 alternatiu a la síntesis química. === "PRODUCTION OF A HIV-1 FUSION INHIBITOR IN TOBACCO AND RICE PLANTS": Plants provide convenient systems for the production of valuable recombinant proteins. Compared with the traditional production systems (i.e. microbial fermentation and mammalian cell cultures), plants have advantages in terms of cost, scalability and safety. Plants can be grown on an agricultural scale reducing the production costs of the recombinant protein and have similar post-translational pathways to animal. This make plants an interesting system for the heterologous production of human therapeutic proteins (Fischer, 1998). In this work we present the efficient production of the HIV-1 fusion inhibitor T20 in tobacco and rice transgenic plants.T20, a 36 amino acids peptide homologous to HR2 region of HIV-1 gp41 envelop protein, belongs to a new class of anti-HIV drugs known as fusion inhibitors (Wild et al., 1993). It has been proposed that T20 inhibits HIV-1 cell entry in T-cell lines by blocking conformational changes of gp41 (Chan et al., 1998, Liu et al., 2005) (fig.1). T20 was licensed on May 2003 by the FDA for the treatment of HIV-infected individuals.It is known that endoplasmic reticulum (ER) retention of recombinant proteins improves their accumulation and stability. Our approach to accumulate high levels of T20 in transgenic plants is based on the ability of proline-rich domains of γ-zein to self-assemble conferring stability to fusion proteins in the ER. γ-Zein is a maize storage protein that naturally accumulates in ER-derived protein bodies (PB) in endosperm cells. Previous studies demonstrated the ability of N-terminal γ-zein region to induce formation of PB in a heterologous plant system (Geli et al, 1994). Four chimeric genes were constructed coding for praline-rich-domains fused to the T20 sequence.We were interested to test the production of T20 fused to ZERATM domains in two different plant systems: tobacco and rice. The expression of the recombinant protein in tobacco provides large amounts of non-food biomass, whereas the expression in crop seeds using a specific promoter permits large storage periods.