Avaluació de la resposta “in vitro” de condròcits humans tractats amb plasma ric en plaquetes (PRP), en presència de LPS o en condicions d’estrés oxidatiu

• Main Author: Viñals Galí, Laia
• Other Authors: Martínez Ramírez, Paz
• Format: Doctoral Thesis
• Language: Catalan
• Published: Universitat Autònoma de Barcelona 2011
• Subjects: Condròcits; Plasma ric en plaquetes (PRP); TGF; Ciències Experimentals; 61
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/96158; http://nbn-resolving.de/urn:isbn:9788449030932

INTRODUCCIÓ: En les patologies articulars que afecten el cartílag existeix una relació bidireccional entre la degradació del teixit i la resposta inflamatòria. El plasma ric en plaquetes conté factors moduladors de la inflamació i promotors de la regeneració. Aquests factors podrien actuar sobre els condròcits modificant-ne l’expressió de citocines i molècules de la matriu cartilaginosa, de forma que es generaria un entorn favorable per la recuperació del dany. OBJECTIUS: Establir models in vitro de condròcits tractats amb LPS i de condròcits tractats amb agents oxidants i avaluar l’efecte del plasma ric en plaquetes sobre aquests models cel·lulars. MATERIAL I MÈTODES: S’han establert cultius primaris de condròcits a partir de biòpsies de cartílag articular i s’han tractat amb LPS (100 μg/ml) o amb H2O2 (1mM) durant 24 h. S’ha valorat l’activitat metabòlica dels condròcits mitjançant la quantificació de glicosaminoglicans (GAGs) en els sobrenadants dels cultius i també s’ha valorat el patró de citocines i factors de creixement (IL-12p70, TNF-_, IL-10, IL-6, IL-1β, IL-8 i TGF-β) alliberats pels condròcits en el sobrenadant, mitjançant citometria de flux o ELISA. S’ha generat plasma ric en plaquetes a partir de sang sencera i se n’ha valorat el contingut en TGF-β. S’han tractat els cultius de condròcits amb PRP (25% i 50%) i s’ha valorat l’activitat metabòlica i el perfil de citocines dels condròcits. RESULTATS: El tractament dels condròcits amb LPS provoca un increment de GAGs i de les citocines TNF-α, IL-6, IL-8 i IL-10 en els sobrenadant, mentre que disminueixen els nivells de TGF-β. A l’afegir PRP ric en TGF-β al cultiu, el TNF-α i la IL-10 del sobrenadant disminueixen. L’oxidació dels condròcits amb H2O2 provoca la disminució de GAGs en el sobrenadant però no altera el perfil de citocines. L’efecte del PRP sobre el cultiu de condròcits en condicions d’oxidació genera un increment de la IL-8 i un lleuger augment de la IL-6. CONCLUSIONS: Els condròcits participen de forma activa en la resposta inflamatòria ja que quan estan en presència d’un agent com el LPS canvien el perfil de citocines inflamatòries i reguladores que sintetitzen. El PRP, ric en TGF-β, modifica el patró de citocines cap a un perfil menys inflamatori i pot promoure la proliferació dels condròcits. El tractament amb PRP de condròcits en un entorn oxidatiu provoca uns efectes similars als del tractament amb PRP sobre cultius normals, però en menor intensitat. === INTRODUCCIÓN:En las patologías articulares que afectan el cartílago existe una relación bidireccional entre la degradación del tejido y la respuesta inflamatoria, de manera que se generan situaciones de inflamación crónica y de perpetuación de la degradación del tejido. El plasma rico en plaquetas (PRP) contiene factores moduladores de la inflamación y promotores de la regeneración como el TGF-β. La hipótesis de este trabajo es que estos factores podrían actuar sobre los condrocitos modificando la expresión de citocinas y de moléculas de la matriz cartilaginosa, de forma que se generaría un entorno favorable para la recuperación del daño. OBJETIVOS: Establecer modelos in vitro de condrocitos tratados con LPS y de condrocitos tratados con agentes oxidantes, y evaluar el efecto del plasma rico en plaquetas (PRP) en estos modelos de daño celular. MATERIALES Y MÉTODOS: Se han establecido cultivos primarios de condrocitos a partir de biopsias de cartílago articular procedentes de pacientes (70-90 años) sometidos a cirugía de reemplazamiento. Se han generado modelos de daño celular tratando cultivos de condrocitos con LPS (100 µg/ml) o con H2O2 (1mM) durante 24 h. Se ha valorado la actividad sintética de los condrocitos con la cuantificación de los glucosaminoglicanos (GAGs) en los sobrenadantes de los cultivos mediante el ensayo colorimétrico DMMB. También se ha valorado el patrón de citocinas inflamatorias y antiinflamatorias, y de factores de crecimiento (IL-12p70, TNF-α, IL-10, IL-6, IL-1β, IL-8 y TGF-β) liberados por los condrocitos en el sobrenadante, mediante citometría de flujo (ensayo CBA) o mediante ELISA. Se ha generado plasma rico en plaquetas mediante centrifugación (460 g) de sangre entera y se ha determinado el contenido de TGF-β después de la activación de las plaquetas con 45mM CaCl2. Se han tratado los diferentes cultivos de condrocitos con PRP (25% y 50%) y se ha valorado el efecto de éste sobre la actividad sintética y el perfil de citocinas de los condrocitos. RESULTADOS:El tratamiento de los condrocitos con LPS provoca un incremento de GAGs y de las citocinas TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 en los sobrenadantes, mientras que los niveles de TGF-β disminuyen. Cuando se añade PRP rico en TGF-β al cultivo, la cantidad de TNF-α y de IL-10 en el sobrenadante disminuye, mientras que la cantidad de IL-6 e IL-8 se mantiene elevada, como también se mantiene la capacidad de síntesis de GAGs. La oxidación de los condrocitos con H2O2 provoca la disminución de GAGs en el sobrenadante, pero no modifica el perfil de citocinas. El efecto del PRP sobre el cultivo de condrocitos en condiciones de oxidación recupera la síntesis de GAGs y genera un incremento de la IL-8 y un ligero aumento de la IL-6. CONCLUSIONES: Los condrocitos participan de forma activa en la respuesta inflamatoria ya que, cuando están en presencia de un agente como el LPS, cambian el perfil de citocinas inflamatorias y reguladoras que sintetizan. Con la adición en el cultivo de PRP, rico en TGF-β, se estaría supliendo la disminución de TGF-β provocada por el LPS en los condrocitos y provocaría el cambio en el patrón de citocinas hacia un perfil menos inflamatorio. Si una situación similar sucediera in vivo, con el uso del PRP, se estaría generando un entorno favorable para la recuperación del daño. El tratamiento in vitro con PRP de condrocitos en un entorno oxidativo, produce efectos similares a los tratamientos con PRP sobre cultivos normales, pero en menor intensidad, pudiendo, eso sí, recuperar la actividad sintética de matriz extracelular. === INTRODUCCIÓN:En las patologías articulares que afectan el cartílago existe una relación bidireccional entre la degradación del tejido y la respuesta inflamatoria, de manera que se generan situaciones de inflamación crónica y de perpetuación de la degradación del tejido. El plasma rico en plaquetas (PRP) contiene factores moduladores de la inflamación y promotores de la regeneración como el TGF-β. La hipótesis de este trabajo es que estos factores podrían actuar sobre los condrocitos modificando la expresión de citocinas y de moléculas de la matriz cartilaginosa, de forma que se generaría un entorno favorable para la recuperación del daño. OBJETIVOS: Establecer modelos in vitro de condrocitos tratados con LPS y de condrocitos tratados con agentes oxidantes, y evaluar el efecto del plasma rico en plaquetas (PRP) en estos modelos de daño celular. MATERIALES Y MÉTODOS: Se han establecido cultivos primarios de condrocitos a partir de biopsias de cartílago articular procedentes de pacientes (70-90 años) sometidos a cirugía de reemplazamiento. Se han generado modelos de daño celular tratando cultivos de condrocitos con LPS (100 µg/ml) o con H2O2 (1mM) durante 24 h. Se ha valorado la actividad sintética de los condrocitos con la cuantificación de los glucosaminoglicanos (GAGs) en los sobrenadantes de los cultivos mediante el ensayo colorimétrico DMMB. También se ha valorado el patrón de citocinas inflamatorias y antiinflamatorias, y de factores de crecimiento (IL-12p70, TNF-α, IL-10, IL-6, IL-1β, IL-8 y TGF-β) liberados por los condrocitos en el sobrenadante, mediante citometría de flujo (ensayo CBA) o mediante ELISA. Se ha generado plasma rico en plaquetas mediante centrifugación (460 g) de sangre entera y se ha determinado el contenido de TGF-β después de la activación de las plaquetas con 45mM CaCl2. Se han tratado los diferentes cultivos de condrocitos con PRP (25% y 50%) y se ha valorado el efecto de éste sobre la actividad sintética y el perfil de citocinas de los condrocitos. RESULTADOS:El tratamiento de los condrocitos con LPS provoca un incremento de GAGs y de las citocinas TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 en los sobrenadantes, mientras que los niveles de TGF-β disminuyen. Cuando se añade PRP rico en TGF-β al cultivo, la cantidad de TNF-α y de IL-10 en el sobrenadante disminuye, mientras que la cantidad de IL-6 e IL-8 se mantiene elevada, como también se mantiene la capacidad de síntesis de GAGs. La oxidación de los condrocitos con H2O2 provoca la disminución de GAGs en el sobrenadante, pero no modifica el perfil de citocinas. El efecto del PRP sobre el cultivo de condrocitos en condiciones de oxidación recupera la síntesis de GAGs y genera un incremento de la IL-8 y un ligero aumento de la IL-6. CONCLUSIONES: Los condrocitos participan de forma activa en la respuesta inflamatoria ya que, cuando están en presencia de un agente como el LPS, cambian el perfil de citocinas inflamatorias y reguladoras que sintetizan. Con la adición en el cultivo de PRP, rico en TGF-β, se estaría supliendo la disminución de TGF-β provocada por el LPS en los condrocitos y provocaría el cambio en el patrón de citocinas hacia un perfil menos inflamatorio. Si una situación similar sucediera in vivo, con el uso del PRP, se estaría generando un entorno favorable para la recuperación del daño. El tratamiento in vitro con PRP de condrocitos en un entorno oxidativo, produce efectos similares a los tratamientos con PRP sobre cultivos normales, pero en menor intensidad, pudiendo, eso sí, recuperar la actividad sintética de matriz extracelular.