Estudio de la inestabilidad cariotípica de levaduras vínicas

• Main Author: Carro Puentedura, David
• Other Authors: Llagostera Casas, Montserrat
• Format: Doctoral Thesis
• Language: Spanish
• Published: Universitat Autònoma de Barcelona 2004
• Subjects: Saccharonyces; Cariotipo; Inestabilidad vínica levadura; Ciències Experimentals; 575
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/3887; http://nbn-resolving.de/urn:isbn:8468965448

Las levaduras silvestres presentan una acusada inestabilidad cariotípica durante el crecimiento vegetativo. Hemos analizado alrededor de 500 cariotipos de derivados mitóticos y meióticos de la cepa vínica silvestre DC5, la cual presenta una frecuencia de inestabilidad cariotípica de 8.2x10-2 cambios/clon/generación. Un 70 % de los derivados meióticos de DC5 presentó una baja frecuencia de inestabilidad cariotípica, con una media de 5.8x10-4 cambios/clon/generación, sugiriendo que la inestabilidad cariotípica es un fenotipo de carácter dominante. Los derivados diploides con una baja tasa de inestabilidad cariotípica mitótica, también presentaron una baja tasa de inestabilidad cariotípica en meoisis, sugiriendo que los dos fenotipos están ligados. La cepa DC5 y alguno de sus derivados meióticos (tanto los de baja como los de alta frecuencia de variabilidad cariotípica) presentaron una manifiesta hipervariabilidad en el cromosoma XII, aunque esta no es un indicativo de inestabilidad genética. Los derivados cariotípicamente inestables, pueden dar lugar a derivados estables con una alta frecuencia.La inestabilidad genética de una cepa dificulta la posibilidad de aplicar programas de mejora genética en ésta para su aplicación industrial. La inestabilidad cariotípica es un fenómeno de carácter dominante, y que depende de pocos elementos genéticos. La disrupción del gen RAD52 en una cepa hipervariable, estabiliza parcialmente su cariotipo. Concretamente la disrupción de RAD52 elimina la recombinación subtelomérica y telomérica, no influye en la hipervariabilidad del cromosoma XII y reduce en un 30% la frecuencia de inestabilidad cariotípica. Por consiguiente, existen al menos tres mecanismos relacionados con la inestabilidad cariotípica en cepas salvajes, de los que dos son independientes de recombinación homóloga- RAD52. El mutante rad52 presentó un fitness industrial equiparable a la cepa salvaje, en la segunda fermentación del cava, en concreto en lo que a capacidad de fermentación vigorosa se refiere. El aislamiento físico y el análisis de algunas variantes de tamaño del cromosoma I en estas cepas, mostró como estas diferían en las regiones subteloméricas, permaneciendo el cuerpo central cromosómico de 150 Kb inalterado. El mapeo fino de dichas regiones subteloméricas, mostró grandes alteraciones en dos loci muy similares, FLO1 y FLO9. Estos loci se localizan en los brazos derecho e izquierdo del cromosoma I. Estos genes poseen secuencias repetidas internas. Algunas variantes del cromosoma I que carecen del gen FLO1 mostraron un evidencias de procesos recombinatorios en regiones del brazo derecho que contienen LTRs y Tys. Por lo tanto proponemos que las secuencias repetidas en algunas regiones subteloméricas de S.cerevisiae pueden jugar un papel la hipervariabilidad cariotípica. Algunas de dichas secuencias codifican proteínas de membrana y de interacción con el medio, por lo que la plasticidad subtelomérica puede implicar un mecanismo de adaptación a substratos específicos. Este patrón semi conservativo de reorganizaciones cromosómicas puede tener importantes implicaciones, tanto desde un punto de vista evolutivo como para diferentes procesos biotecnológicos. === Yeast strains isolated from the wild may show high rates of changes in their karyotypes during vegetative growth. We analysed over 500 karyotypes from mitotic and meiotic derivatives of strain DC5, which has a chromosome rearrangement rate of 8.2x10-2 changes/generation. About 70% of the meiotic derivatives of DC5 had low rearrangement rates, with an average of 5.8x10-4 changes/generation, suggesting that karyotype instability behaved as a dominant phenotype. Diploid derivatives with low karyotype variability in mitosis also had low rates of chromosomal rearrangement during meiosis, suggesting that the two phenotypes may be linked. DC5 and some of its meiotic derivatives (both with high and low karyotype variability) had chromosome XII hypervariable bands. Their distribution among the meiotic products indicates that they are not indicators for genetic instability. Karyotypically unstable yeast strains may give stable progeny at high rates. The genetic instability compromises their utility in genetic improvement projects for industrial purposes. Karyotype instability is a dominant trait, segregating among meiotic derivatives as if it depended upon only a few genetic elements. We show that disrupting the RAD52 gene in a hypervariable strain partially stabilizes its karyotype. Specifically, RAD52 disruption eliminated recombination at telomeric and subtelomeric sequences, had no influence on ribosomal DNA rearrangement rates, and reduced to 30% the rate of changes in chromosomal size. Thus, there are at least three mechanisms related to karyotype instability in wild yeast strains, two of them not requiring RAD52-mediated homologous recombination. When utilized for a standard sparkling-wine second fermentation, rad52 strains retained the enological properties of the parental strain, specifically its vigorous fermentation capability. Physical isolation and analysis of several chromosome I size variants of one of these strains revealed that they differed only in their subtelomeric regions, leaving the central 150 Kb unaltered. Fine mapping of these subtelomeric variable regions revealed gross alterations of two very similar loci, FLO1 and FLO9. These loci are located on the right and left arms, respectively, of chromosome I and encompass internal repetitive DNA sequences. Furthermore, some chromosome I variants lacking the FLO1 locus showed evidence of recombination at a DNA region on their right arm that is enriched in repeated sequences, including Ty LTRs. We propose that repetitive sequences in many subtelomeric regions in S. cerevisiae play a key role in karyotype hypervariability. As these regions encode several membrane-associated proteins, subtelomeric plasticity may allow rapid adaptive changes of the yeast strain to specific substrates. This pattern of semi-conservative chromosomal rearrangement may have profound implications, both in terms of evolution of wild strains and for biotechnological processes.