Evolució del motiu d'unió de la proteïna LexA al Domini Bacteria

• Main Author: Mazón i Busquets, Gerard
• Other Authors: Barbé García, Jordi
• Format: Doctoral Thesis
• Language: Catalan
• Published: Universitat Autònoma de Barcelona 2004
• Subjects: Evolució; Sistema SOS; LexA; Ciències Experimentals; 579
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/3877; http://nbn-resolving.de/urn:isbn:8468909564

El sistema SOS és una xarxa multigénico induïble davant del dany al DNA. Les seves funcions estan relacionades amb la replicació, reparació del DNA, mutagènesi I control del cicle cel·lular. Aquesta xarxa ha estat caracteritzada per diferents bacteris grampositius i gramnegatius, trobant-se per a tots ells un motiu d'unió del seu repressor, la proteïna LexA.El present treball de Tesi es centra en la caracterització del motiu d'unió de la proteïna LexA a Xylella fastidiosa, Anabaena sp. i Fibrobacter succinogenes. Mitjançant recerques amb el programa TBLASTN, els gens lexA d'aquests microorganismes han estat identificats. Després de procedir a la seva clonació, els productes que codifiquen han estat expressats I purificats mitjançant sistemes d'afinitat a la cua d'histidines o a la GST. Assaigs de mobilitat electroforética i de footprinting utilitzant el promotor de lexA i proteïna purificada, ens han permès definir el motiu d'unió de la proteïna LexA a tots tres microorganismes: TTAGN6TACTA per a X. fastidiosa, RGTACNNNDGTWCB per a Anabaena i TGCNCN4GTGCA per a F. succinogenes.Aquests motius d'unió han estat utilitzats per determinar la composició del reguló LexA a l'ordre Xanthomonadals i als phyla Cianobacteris i Fibrobacter. Aquest estudi ens ha permès descriure una important variabilitat en la composició d'aquests regulons i la presència de gens induïbles davant del dany al DNA de manera independent de LexA a X.fastidiosa.Estudis de mutagènesis dirigida utilitzant les seqüències d'unió de la proteïna LexA a Anabaena i F. succinogenes i estudis filogenètics amb les proteïnes LexA i RecA ens han permès determinar la història evolutiva del motiu d'unió de LexA al Domini Bacteria, demostrant que a la subdivisió 'Alphaproteobacteria' s'ha perdut la còpia del gen lexA heretada verticalment essent la que presenten actualment aquests bacteris una adquisició per transferència horitzontal a partir d'un ancestre d'una cianobactèria o espècie relacionada.Els següents articles donen suport a les dades i conclusions del treball, que ha estat redactat com a compendi d'aquestes publicacions :Campoy, S., Mazón, G., Fernández de Henestrosa, A.R., Llagostera, M., Monteiro, P.B. i Barbé, J. 2002. A new regulatory DNA motif of the gamma subclass Proteobacteria: identification of the LexA protein binding site of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Microbiology 148: 3583 - 3597.Mazón G., Lucena J.M., Campoy, S., Fernández de Henestrosa, A.R., Candau, P. i Barbé J. 2004. LexA-binding sequence in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Mol. Gen. Genomics 271: 40 - 49.Mazón, G., Erill, I., Campoy, S., Cortés, P., Forano, E. i Barbé, J. 2004. Reconstruction of the evolutionary history of the LexA binding sequence. Microbiology 150: 3783-3795. === The SOS network is a DNA-damage inducible multigenic network whose functions are involved in DNA replication, DNA repair, mutagenesis and control of cell cycle. This network has been characterized in different gram-positive and gram-negative bacterial species. A binding-motif for their repressor, the LexA protein, has been already determined.The present work focuses in the characterization of the LexA-binding motif of Xylella fastidiosa, Anabaena sp. and Fibrobacter succinogenes. Using TBLASTN searches, their respective lexA genes have been identified and cloned, and their products expressed and purified using histidine-tag and GST-tag systems. Electrophoretic mobility shift assays and foot-printing experiments performed using purified LexA proteins and their lexA promoter fragments revealed the presence of the specific LexA-binding motif for these microorganisms: TTAGN6TACTA for X. fastidiosa, RGTACNNNDGTWCB for Anabaena and TGCNCN4GTGCA for F. succinogenes.These three binding motifs have been used to elucidate the LexA regulon composition in the Order Xanthomonadales and the Cyanobacteria and Fibrobacter phyla, showing an important variability in their regulon composition and the presence of LexA-independent DNA-damage inducible genes in X. fastidiosa.Directed mutagenesis of the Anabaena and F. succinogenes LexA-binding sequences and phylogenetic analyses of LexA and RecA proteins have revealed the evolutionary history of the LexA-binding motif in the Bacteria Domain, with the loss of the vertically inherited lexA gene in 'Alphaproteobacteria' and the presence of a lateral gene transfer in these group resulting in a new lexA copy acquired from a cyanobacterium ancestor or related species.This work is supported on data published in the following papers:Campoy, S., Mazón, G., Fernández de Henestrosa, A.R., Llagostera, M., Monteiro, P.B. i Barbé, J. 2002. A new regulatory DNA motif of the gamma subclass Proteobacteria: identification of the LexA protein binding site of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Microbiology 148: 3583 - 3597.Mazón G., Lucena J.M., Campoy, S., Fernández de Henestrosa, A.R., Candau, P. i Barbé J. 2004. LexA-binding sequence in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Mol. Gen. Genomics 271: 40 - 49.Mazón, G., Erill, I., Campoy, S., Cortés, P., Forano, E. i Barbé, J. 2004. Reconstruction of the evolutionary history of the LexA binding sequence. Microbiology 150: 3783-3795.