Nitrate: metabolism and development : characterization of the glutamate dehydrogenase (GDH) family, an enzyme at the cross-roads of carbon-nitrogen interaction metabolites and study of the regulation of flowering by nitrogen

• Main Author: Castro Marin, Inmaculada
• Format: Doctoral Thesis
• Language: English
• Published: Universität Potsdam 2007
• Subjects: Nitrat; Stoffwechsel; Entwicklung; Arabidopsis thaliana; Nitrate; Metabolism; Development; Life sciences
• Online Access: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-18827; http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2008/1882/

The major aim of this thesis was to study the effect of nitrate on primary metabolism and in development of the model plant Arabidopsis thaliana. The present work has two separate topics. First, to investigate the GDH family, a small gene family at the interface between nitrogen and carbon metabolisms. Second, to investigate the mechanisms whereby nitrogen is regulating the transition to flowering time in Arabidopsis thaliana. To gain more insights into the regulation of primary metabolism by the functional characterization of the glutamate dehydrogenase (GDH) family, an enzyme putatively involved in the metabolism of amino acids and thus suggested to play different and essential roles in carbon and nitrogen metabolism in plants, knock out mutants and transgenic plants carrying RNA interference construct were generated and characterized. The effect of silencing GDH on carbon and nitrogen metabolisms was investigated, especially the level of carbohydrates and the amino acid pool were further analysed. It has been shown that GDH expression is regulated by light and/or sugar status therefore, phenotypic and metabolic analysis were developed in plants grown at different points of the diurnal rhythm and in response to an extended night period. In addition, we are interested in the effect of nutrient availability in the transition from vegetative growth to flowering and especially in nitrate as a metabolite that triggers widespread and coordinated changes in metabolism and development. Nutrient availability has a dramatic effect on flowering time, with a marked delay of flowering when nitrate is supplied (Stitt, 1999). The use of different mutants and transgenic plants impaired in flowering signalling pathways was crucial to evaluate the impact of different nitrate concentrations on flowering time and to better understand the interaction of nitrate-dependent signals with other main flowering signalling pathways. Plants were grown on glutamine as a constitutive source of nitrogen, and the nitrate supply varied. Low nitrate led to earlier flowering. The response to nitrate is accentuated in short days and in the CONSTANS deficient co2 mutant, whereas long days or overexpression of CONSTANS overrides the nitrate response. These results indicate that nitrates acts downstream of the known flowering signalling pathways for photoperiod, autonomy, vernalization and gibberellic acid. Global analyses of gene expression of two independent flowering systems, a light impaired mutant (co2tt4) and a constitutive over-expresser of the potent repressor of flowering (35S::FLC), were to be investigated under two different concentrations of nitrate in order to identify candidate genes that may be involved in the regulation of flowering time by nitrate. === Das Hauptziel dieser Doktorarbeit war die Untersuchung des Effekts von Stickstoff auf den Primärmetabolisms und auf die Entwicklung der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Die vorliegende Arbeit hat zwei Unterthemen: Auf der einen Seite wurde die GDH Familie untersucht, eine kleine Genfamilie an der Schnittstelle zwischen Stick –und Kohlenstoffmetabolismus. Auf der anderen Seite wurde der Mechanismus, bei dem Stickstoff die Blütezeit in Arabidopsis thaliana kontrolliert, untersucht. Um einen tieferen Einblick in die Regulierung des Primärmetabolismus zu erhalten, wurde eine funktionelle Charakterisierung der Glutamatdehydrogenase-Familie (GDH) mit Hilfe von knock-out Mutanten und transgenen Pflanzen, die ein RNA Interferenzkonstrukt tragen, durchgeführt. GDH ist höchstwahrscheinlich am Aminosäuremetabolismus beteiligt, wobei vermutet wird, dass es verschiedene wichtige Aufgaben im Pflanzenkohlen –und stickstoffmetabolismus übernimmt. Dabei wurde der Effekt des GDH Silencing auf den Kohlen- sowie Stickstoffmetabolismus untersucht und insbesondere die Anteile von Kohlenhydraten und Aminosäuren eingehend analysiert. In vorhergehenden Studien zeigte sich, dass die GDH-Expression durch Licht und/oder die Zuckerverfügbarkeit reguliert wird. Deshalb wurden phenotypische und metabolische Analysen an Pflanzen entwickelt, die zu verschiedenen Zeitpunkten des diurnalen Rhythmus und nach einer längeren Nachtperiode gezüchtet wurden. Ausserdem interesssiert uns der Effekt der Nährstoffverfügbarkeit im Übergang vom vegetativen Wachstum zur Blüte, und vor allen Dingen Nitrat als Metabolit, welches weitreichende und koordinierte Veränderungen im Metabolismus und in der Entwicklung hervorruft. Die Nährstoffverfügbarkeit hat einen dramatischen Effekt auf die Blütezeit, insbesondere führt eine Nitratzugabe zu einer deutlichen Verzögerung der Blüte (Stitt, 1999). Der Einsatz von verschiedenen Mutanten und transgenen Pflanzen, die eine Blockade im Blüte-Signalweg aufwiesen, war ausschlaggebend, um den Einfluss von unterschiedlichen Nitratkonzentrationen auf die Blütezeit zu beurteilen, und um zu einem besserem Verständnis des Zusammenspiels von nitratabhängigen Signalen und anderen Blüte-Signalwegen zu gelangen. Die Pflanzen wuchsen auf Glutamin, das als konstitutive Stickstoffquelle diente, wobei die Nitratversorgung variierte. Niedriger Nitratanteil führte zu einer früheren Blüte. Bei kurzer Tageslänge und bei CONSTANS defizienten Mutanten (co2) ist die Reaktion auf Nitratzugabe erhöht, wohingegen bei fortgeschrittener Tageslänge oder bei Überexpression von CONSTANS die Reaktion auf Nitrat unterbleibt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Nitrat unterhalb der bekannten Blüte-Signalwege für Photoperiode, Autonomie, Vernalisierung und Gibberelinsäure fungiert. Globale Expressionsanalysen von zwei unterschiedlichen Blütensystemen, eine licht-unempfindliche Mutante (co2tt4) und eine Mutante mit konstitutiver Expression eines potentiellen Blüte-Repressors (35S::FLC), wurden bei zwei verschiedenen Nitratkonzentrationen durchgeführt, um Kandidatengene zu identifizieren, die eine wichtige Rolle in der Regulation der Blütezeit durch Nitrat spielen könnten.