Humane Alkoholdehydrogenasen und Aldehyddehydrogenasen : Bedeutung für den Metabolismus von Methylpyrenderivaten und von 5-(Hydroxymethyl)-2-furfural
Alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (alk-PAK) kommen zusammen mit rein aromatischen polyzyklischen Kohlenwasserstoffen u.a. im Zigarettenrauch, Dieselabgasen sowie einigen Lebensmitteln (z.B. Freilandgemüse, planzliche Öle und Fette) vor. Benzylische Hydroxylierung und nachfolgen...
| Main Author: | |
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| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Universität Potsdam
2007
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| Subjects: | |
| Online Access: | http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-15703 http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2007/1570/ |
| Summary: | Alkylierte polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (alk-PAK) kommen zusammen mit rein aromatischen polyzyklischen Kohlenwasserstoffen u.a. im Zigarettenrauch, Dieselabgasen sowie einigen Lebensmitteln (z.B. Freilandgemüse, planzliche Öle und Fette) vor. Benzylische Hydroxylierung und nachfolgende Sulfokonjugation ist ein wichtiger Bioaktivierungsweg für einige alk-PAK. Oxidation der benzylischen Alkohole durch Alkoholdehydrogenasen (ADH) und Aldehyddehydrogenasen (ALDH) zur Carbonsäure könnte einen wichtigen Detoxifizierungsweg in Konkurrenz zur Aktivierung durch Sulfotransferasen (SULT) darstellen, was für 1-Hydroxymethylpyren in der Ratte bereits gezeigt wurde (Ma, L., Kuhlow, A. & Glatt, H. (2002). Polycyclic Aromat Compnds 22, 933-946). Durch Hemmung der ADH und/oder ALDH ist eine verstärkte Aktivierung zu erwarten, wie in der besagten Studie ebenfalls nachgewiesen wurde. Insbesondere Ethanol kommt in diesem Zusammenhang eine Rolle als möglicher Risikofaktor für alk-PAK induzierte Kanzerogenese zu. Menschen konsumieren häufig große Mengen Ethanol und oft besteht eine Koexposition mit alk-PAK (z.B. durch Rauchen). Ähnliches gilt für 5-(Hydroxymethyl)-2-furfural (HMF), einem Pyrolyseprodukt reduzierender Zucker, dem gegenüber Menschen in recht hohen Mengen exponiert sind. Auch bei HMF steht der ADH- und ALDH-vermittelte oxidative Metabolismus in Konkurrenz zu einer Aktivierung durch Sulfokonjugation. Um die Bedeutung humaner ADH und ALDH im Metabolismus von alk-PAK und von HMF aufzuklären, wurden alle bekannten humanen ADH sowie die humanen ALDH2 und 3A1 (aus theoretischen Überlegungen heraus die vielversprechendsten Formen) für kinetische Analysen in Bakterien exprimiert. Als Enzymquelle dienten zytosolische Präparationen und durch Anionenaustauschchromatographie partiell gereinigte Enzyme.
In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass primäre benzylische Alkohole von Methyl- und Dimethylpyrenen gute Substrate humaner ADH sind. Sekundäre benzylische Alkohole und benzylische Alkohole von alk-PAK mit größerem Kohlenwasserstoffgrundgerüst erwiesen sich dagegen als schlechte Substrate. Vier Formen (ADH1C, 2, 3 und 4) wurden näher analysiert. Dazu wurden sie partiell gereinigt, primär um die störende endogene Bakterien-ADH zu eliminieren. Alle untersuchten ADH waren in der Lage Pyrenylmethanole zu oxidieren. Insbesondere ADH2 katalysierte die Oxidation der Pyrenylmethanole effizient, aber auch für ADH1C und 4 waren die Pyrenylmethanole gute Substrate. ADH3 oxidierte die Pyrenylmethanole mit geringer katalytischer Effizienz. Die Reduktion der entsprechenden Pyrenaldehyde durch ADH1C, 2 und 4 wurde mit noch höherer Effizienz katalysiert als die Oxidation der Pyrenylmethanole, was die Bedeutung von ALDH für die effiziente Detoxifizierung dieser Verbindungen unterstreicht. In einer an diese Arbeit angelehnten Diplomarbeit (Rost, K. (2007). Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät) wurde auch tatsächlich gezeigt, dass humane ALDH2 aber auch ALDH3A1 in der Lage sind, die Pyrenaldehyde zu Pyrenylcarbonsäuren zu oxidieren. Die bestimmten kinetischen Parameter legen nahe, dass insbesondere ALDH2 von Bedeutung für die Detoxifizierung von Methyl- und Dimethylpyrenen ist. Schon allein auf Grund der an der Detoxifizierung beteiligten Enzyme ist Ethanolaufnahme bei Koexposition mit Pyrenderivaten als Risiokofaktor anzusehen. Es ist wahrscheinlich, dass Ethanol und, nach dessen Oxidation, Acetaldehyd als konkurrierende Substrate die ADH- und ALDH-katalysierte Oxidation von Pyrenylmethanolen bzw. Pyrenaldehyden inhibieren und somit zu einer verstärkten SULT-vermittelten Aktivierung der Pyrenylmethanole führen. In der Tat wurde eine effiziente Inhibition der ADH2-katalysierten Oxidation von 1-Hydroxymethylpyren und von 1-(Hydroxymethyl)-8-methylpyren durch physiologisch relevante Ethanolkonzentrationen nachgewiesen.
Drei humane ADH (4, 2 und 3), die HMF effizient zum 2,5-Diformylfuran oxidieren können, wurden identifiziert. Durch ALDH-katalysierte Weiteroxidation dieser Substanz entsteht schließlich 2,5-Furandicarbonsäure, die nach HMF-Exposition auch tatsächlich im menschlichen Urin gefunden wurde (Jellum, E., Børresen, H. C. & Eldjarn, L. (1973). Clin Chim Acta 47, 191-201). Weiter wurde gezeigt, dass ALDH3A1, aber auch ALDH2 HMF effizient zur 5-(Hydroxymethyl)-2-furancarbonsäure (HMFA) oxidieren können, ein weiterer nachgewiesener HMF Metabolit in vivo. Dass die ADH-katalysierte Oxidation von HMFA und nachfolgende ALDH-katalysierte Oxidation zur Bildung von 2,5-Furandicarbonsäure einen nennenswerten Anteil beträgt, kann aufgrund der kinetischen Daten für HMFA als Substrat humaner ADH ausgeschlossen werden. Die beobachteten Enzymaktivitäten lassen den Schluss zu, dass Ethanolaufnahme zu einer Reduktion des oxidativen HMF Metabolismus führt und somit eine Aktivierung von HMF durch Sulfokonjugation begünstigt. === Alkylated polycyclic aromatic hydrocabons (alk-PAH), together with purely aromatic PAH, are present e.g. in tobacco smoke, diesel exhausts and also in some foods (e.g. outdoor vegetables, vegetable oils). Benzylic hydroxylation and subsequent sulfo conjugation is an important metabolic activation pathway for some of these compounds. Nevertheless, oxidation of the benzylic alcohols by alcohol dehydrogenases (ADH) and subsequently by aldehyde dehydrogenases (ALDH) can compete with the sulfo conjugation. Therefore, this pathway is probably important in the detoxification as could be shown for the representative compound 1-hydroxymethylpyrene in the rat (Ma, L., Kuhlow, A. & Glatt, H. (2002). Polycyclic Aromat Compnds 22, 933-946). Inhibition of ADH and/or ALDH should increase bioactivation as indeed was shown for 1-hydroxymethylpyrene in this study. Particularly ethanol, a competing ADH substrate, is of high interest in this context. Humans often consume large quantities of ethanol and often they are coexposed to alk-PAH (e.g. due to tobacco smoking). Similar relationships can be considered for 5-(hydroxymethyl)-2-furfural (HMF), a common pyrolysate of reducing sugars with high exposure to humans. Oxidative metabolism of HMF by ADH and ALDH also competes with its bioactivation by sulfotransferases (SULT). To clarify the importance of human ADH and ALDH in the metabolism of alk-PAH and HMF, all known human ADH as well as human ALDH2 and 3A1 (the most promising forms according to theoretical considerations) were expressed in bacteria for kinetic anlalyses. Cytosolic preparations or enzymes partially purified by anion exchange chromatography were used as enzyme source.
In the present study it was shown that primary benzylic alcohols of methyl- and dimethylpyrenes were good substrates for human ADH. However, secondary benzylic alcohols and benzylic alcohols derived from alk-PAH with a bulkier hydrocarbon skeletal were poor substrates for human ADH. The most promising forms (ADH1C, 2, 3 and 4) were partially purified and further analysed. The purification step was necessary to eliminate the bacterial ADH. Particularly ADH2 was efficient for oxidation of pyrenylmethanols, although ADH1C and 4 were relatively efficient too. ADH3 was also capable of oxidising the tested pyrenylmethanols but with low catalytic efficiency. The reduction of the corresponding pyrene aldehydes was catalysed by ADH1C, 2 and 4 even with higher efficiency than the oxidation of the pyrenylmethanols emphasising the importance of ALDH for the detoxification of these compounds. In a diploma work related to the present study (Rost, K. (2007). University of Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät) it was shown that human ALDH2, but also ALDH3A1, can oxidise pyrene aldehydes to pyrenylcarboxylic acids. Particularly ALDH2 efficiently catalyse these reactions and, therefore, is probably of importance for the detoxification of methyl- and dimethylpyrenes. Due to the enzymes involved ethanol consumption could be a risk factor for methyl- and dimethylpyrene induced damage in the case of coexposure to methyl- and dimethylpyrenes. It is probable that ethanol and, after its oxidation, acetaldehyde will inhibit the ADH- and ALDH-catalysed oxidation of pyrenylmethanols and pyrenealdehydes. Indeed, it was shown that ADH2 catalysed oxidation of 1-hydroxymethylpyrene and of 1-(hydroxymethyl)-8-methylpyrene was efficiently inhibited by physiologically attainable concentrations of ethanol.
Three human ADHs (4, 2 and 3) that efficiently oxidise HMF to 2,5-diformylfuran were identified. Further oxidation by ALDH leads to 2,5-furandicarboxylic acid, which was found in human urine after exposure to HMF (Jellum, E., Børresen, H. C. & Eldjarn, L. (1973). Clin Chim Acta 47, 191-201). Moreover, it was shown that human ALDH3A1 and also ALDH2 efficiently oxidise HMF to 5-(hydroxymethyl)-2-furancarboxylic acid (HMFA), which was also found in human urine. That 2,5-furandicarboxylic acid can be formed in significant amounts by ADH-catalysed oxidation of HMFA and subsequent oxidation by ALDH could be ruled out due to the kinetic data with HMFA as a substrate for human ADH. Due to the enzymes involved it is probable that ethanol consumption will inhibit the oxidative metabolism of HMF and, therefore, will increase the sulfo conjugation of HMF.
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