| Summary: | HHV-6 is a ubiquitous human herpesvirus. Most individuals become infected at the age of 2 years. Primary infection by the virus causes a self-limiting febrile illness called exanthem subitum or roseola. In adults, primary infection may cause mononucleosis-like illnesses. The infection usually remains latent in healthy individuals, but often reactivates in immunocompromised individuals, for example, transplant patients and
AIDS patients. The virus has also been associated with cancers and lymphoproliferative disorders. The virus encodes two proteins that interact with p53. However, little is known concerning the impact of the virus on cell cycle progression in human cells. The investigations reported in the thesis were focused on this issue.
We show here that that HHV-6 infection delays the cell cycle progression in human T cell line HSB-2, as well as in primary human T cells and causes their accumulation in S and G2/M phase. By degrading the viral DNA in the virus-infected cells, we show that the infected cells accumulate in the G2/M and not in the S phase. We observed an increase in the kinase activity of cdc2 in virus-infected cells despite lower levels of its catalytic partners, cyclin A and cyclin B. We show here that the viral early antigen p41 associates with, and increases the kinase activity of, CDK1. Our studies have shown that there is a drastic reduction of p21 protein, despite the virus-induced stabilization and activation of p53 suggesting that p53 may be transcriptionally inactivated in the virus-infected cells. This decrease of p21 in infected cells was partially restored by proteasome inhibitors. These results suggest that HHV-6 causes perturbations in the normal progression of cell cycle in human T cells.
Autophagy is a physiological cell process during which old cellular constituents and long-lived proteins in cells are degraded. This process is regulated in a cell cycle-dependent manner. We show here that infection with HHV-6 induces autophagy in HSB-2 cells. This was shown by the induction of LC-3 II as well as by the appearance of autophagic vacuoles in the virus-infected cells. However, we found that the virus inhibits fusion between autophagic vacuoles and lysosomes formed in infected cells, thus evading the autophagic response of infected host cells.
Finally we tried to investigate replication of the virus in human cells in the absence of P53; a tumor suppressor gene which is also known as "the guardian of the genome ".
During these investigations, we found that that inhibition of p53 gene expression mediated by siRNA as well as its inhibition by pharmacological inhibitors leads to massive cell death in human T cell line HSB-2 that carries a wild-type p53. We show that this death also occurs in another cell line CEM, which carries a transcriptionally mutated p53.
Interestingly, the cell death could be prevented by pharmacological inhibitors of autophagy and necroptosis.
Taken together, our results provide important novel insights concerning the impact of HHV-6 on cell cycle regulation and autophagy as well as of basal level p53 in cell survival. === HHV-6 est un virus herpès humain ubiquitaire. La plupart des individus deviennent séropositifs à l’âge de 2 ans. L’infection primaire par HHV-6 donne lieu à une maladie fébrile chez les enfants, appelée exanthème subitum ou la roséole. Par contre, chez l'adulte, cette infection cause des maladies de type mononucléose. L'infection reste généralement latente chez les individus sains, mais elle se réactive souvent chez les personnes immunodéprimées, par exemple, chez les personnes greffées et les patients atteints du sida. HHV-6 a été associé à plusieurs types de cancers et de désordres lymphoprolifératifs. Ce virus induit l’immunosuppression et inhibe la prolifération des lymphocytes par les mitogènes. C’est pour toutes ces raisons que nous voulions savoir si ce virus dérègle le cycle cellulaire des cellules qu’il infecte. Les travaux réalisés durant cette thèse ont porté sur les changements induits dans les cellules humaines par ce virus au cours de la progression du cycle cellulaire.
Nous avons montré que l'infection par HHV-6 retarde la progression du cycle cellulaire dans la lignée cellulaire T humaine HSB-2, ainsi que dans les lymphocytes T primaires humains pour les accumuler dans les phases S et G2/M. Cependant, après avoir traité les cellules avec la nucléase du Micrococcus, nous avons constaté que le cycle cellulaire des cellules infectées s’accumulait plutôt dans la phase G2/M. La nucléase dégrade préférentiellement l’ADN virale. Nous avons observé une augmentation de l'activité kinase de cdc2 dans les cellules infectées malgré une baisse des niveaux de ses partenaires catalytiques, la cycline A et la cycline B. Nos études ont montré qu’il y a une diminution drastique de la protéine p21 dans les cellules infectées, en dépit de la stabilisation et de l'activation de p53 induite dans ces cellules. Ce qui laisse penser que la protéine p53 pourrait être inactive sur le plan transcriptionnel dans les cellules infectées. Cette diminution de p21 dans les cellules infectées est partiellement restaurée après incubation des cellules dans un milieu de culture contenant des inhibiteurs du protéasome. En plus, nous démontrons ici qu’une protéine virale précoce, p41, s’associe et se fixe avec cdc2 et augmente son activité kinase. Tous ces résultats suggèrent que HHV-6 provoque des perturbations énormes dans la progression normale du cycle cellulaire dans les cellules T humaines. Dans ces études, nous avons démontré aussi que l’infection par HHV-6 induit l'autophagie dans les cellules HSB-2, comme il a été démontré par l’induction de LC-3 II et par la formation de vacuoles autophagiques dans les cellules qui sont infectées. Nos résultats indiquent que HHV-6 inhibe la fusion entre les vacuoles autophagiques formées et les lysosomes dans les cellules infectées modulant ainsi la réponse autophagique des cellules hôtes infectées. Nous avons trouvé aussi que l’inhibition de ce processus par un inhibiteur pharmacologique diminue la réplication virale. L'autophagie est un processus physiologique cellulaire pendant lequel les vieux constituants cellulaires (mitochondries, protéines cellulaires, etc) se dégradent. Le fait que ce processus soit modulé dans les cellules dépendantes des différentes phases du cycle cellulaire, nous a poussé à l’étudier. Enfin, nous essayons d’investiguer la réplication virale dans les cellules dépourvues de p53, le gène suppresseur de tumeur, qui contrôle la progression de cycle cellulaire. Nous avons émis l’hypothèse suivante, que ces virus peuvent mieux se répliquer dans les cellules n’exprimant pas le gène p53. En vérifiant cette hypothèse, nous avons trouvé que l'inhibition de l’expression de p53 provoquée par siRNA ou par un agent pharmacologique conduit à une mort cellulaire massive dans une lignée de cellules T humaines ayant un gène p53 de type sauvage. Nous démontrons que cette mort se produit aussi dans une autre lignée cellulaire dont le p53 est muté et qu’elle pourrait être évitée par des inhibiteurs d'autophagie ou de nécroptose. Nos observations mettent en évidence qu’un niveau d’expression basale de p53 est nécessaire à la survie cellulaire.
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