| Summary: | Clathrin-coated vesicles (CCVs) are responsible for the transport of proteins between various compartments of the secretory and endocytic systems. Clathrinforms a scaffold around these vesicles and is linked to membranes by clathrin adaptors. The adaptor complexes, AP-2 and AP-1, are key hubs in CCV formation at the plasma membrane and trans-Golgi network (TGN), respectively. They recruit cargo, clathrin and a multitude of accessory proteins. The adaptin, or ear, domains play a critical role in recruiting accessory proteins through binding of specific peptide motifs, such as the FXDXF motif. NECAPs are a family of accessory proteins that enrich in CCVs and associate with AP-2 and AP-1. NECAP1 expression levels are highest in the neuronal cells while NECAP2 is ubiquitously expressed. Structural studies of NECAP1 reveal the fold to be part of the pleckstrin homology (PH) domain superfamily and it mimics AP-2 α-ear binding of FXDXF motifs. Therefore the globular region of NECAP is termed the PHear (PH fold with ear-like function) domain. NECAP1 consists of the PHear domain between amino acids 1-133, and a conserved region that is intrinsically unfolded between 134-178, with the entire unfolded region between amino acids 134-275. This thesis has found using nuclear magnetic resonance (NMR) that the NECAP1 construct 1-178 has a two-fold weaker binding affinity to an FXDXF peptide in comparison to the construct 1-133, with binding constants (KD) of 620 micromolar and 330 micromolar respectively. The decrease in binding affinity is attributed to an interaction between the unfolded region and the PHear domain, with a KD between 4000 and 1000 micromolar. === Les vésicules enduites de clathrine (CCVs pour Clathrin-coated vesicles) sont responsables du transport de protéines entre divers compartiments des systèmes sécréteurs et endocytiques. Les protéines clathrine forment un échafaudage autour de ces vésicules ces dernières sont liées aux membranes par des adaptateurs de clathrine. Les complexes d'adaptateurs, AP-2 et AP-1, sont les points de jonction principaux dans la formation des vésicules enduites de clathrine à la membrane de plasma et au réseau transport-Golgi (TGN), respectivement. Ils recrutent la cargaison, la clathrine et une multitude de protéines accessoires. Les domaines adaptin (aussi appelés domaines oreilles) jouent un rôle critique dans le recrutement des protéines accessoires en se liant à des motifs peptides spécifiques, tels que le motif FXDXF. Les NECAPs sont une famille de protéines accessoires qui se concentrent dans les CCVs et qui s'associent à AP-2 et à AP-1. Les niveaux d'expression NECAP1 sont les plus élevés dans les cellules neuronales tandis que NECAP2 est présente unanimement. Des études structurales de NECAP1 indiquent le pli de la protéine fait d'elle un membre de la superfamille des domaines homologues de pleckstrin (pH). Ces dernières ont comme fonction d'imiter le point d'attache du domaine « α-ear » de AP-2 aux motifs FXDXF. Par conséquent, la région globulaire de NECAP se nomme le domaine PHear (PH fold with ear like function, ou pli PH avec fonction similaire au domaine « ear »).Le domaine PHear de NECAP1 est délimité par les acides aminés 1-133. De plus, la proteine comprend une région conservée qui est intrinsèquement non structurée entre les acides aminés 134 et 178; la totalité de cette région non structuré est comprise entière entre les acides aminés 134 et 275. Cette thèse démontre, en utilisant la résonance magnétique nucléaire (RMN), qu'un segment de NECAP1 composé des acides aminés 1 à 178 a une affinité envers un peptide FXDXF deux fois plus faible que celle d'un segment composé des acides aminés 1 à 133. Les constantes KD étaient de 620 micromolaire et de 330 micromolaire respectivement. La diminution de l'affinité de liaison est attribuée à une interaction entre la région non structurée et le domaine de PHear, avec une constante KD entre 4000 et 1000 micromolaire.
|
|---|
