TonB-protein interactions in nutrient uptake systems of «Escherichia coli»

• Main Author: James, Karron
• Other Authors: James W Coulton (Internal/Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2010
• Subjects: Biology - Microbiology
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=86777

Nutrient acquisition by Gram-negative bacteria requires strategies for passage across the outer membrane (OM). Because iron is a vital nutrient for bacteria, we aim to elucidate the molecular mechanism of its uptake. === In an aerobic environment, ferric iron is predominant but exhibits low solubility. To overcome this challenge, bacteria import siderophores, ferric iron chelators. Siderophore import involves its binding to an OM receptor then to a periplasmic binding protein (PBP). Cytoplasmic membrane-embedded protein TonB, through its interaction with the periplasmic face of OM receptors, may provide energy to facilitate nutrient uptake. === To explore the molecular mechanism of TonB-dependent transport, we probed for conformational changes in FhuA, OM receptor for hydroxamate siderophores, in response to TonB binding. We defined epitopes for anti-FhuA monoclonal antibodies (mAbs) and monitored binding of these mAbs to FhuA with and without bound TonB. The most striking changes in binding kinetics were observed for mAb binding to extracellular loops of FhuA. We further explored these changes by conjugating a fluorophore, MDCC, to an extracellular loop of FhuA to monitor changes in fluorescence. Binding of TonB to FhuA quenched MDCC fluorescence. === Investigating events at another stage of TonB-dependent nutrient uptake, we previously discovered interactions between TonB and FhuD, PBP for hydroxamate siderophores. To determine whether such interaction occurs in other TonB-dependent uptake systems, we investigated binding of TonB to BtuF, PBP for cyanocobalamin. By phage display, we predicted a TonB-BtuF interaction by identifying potential binding residues on each protein. Further, we confirmed in vitro interaction between these proteins. TonB-BtuF binding stoichiometry was 1:1 and independent of cyanocobalamin. === In summary, binding of TonB to the periplasmic face of FhuA induced conformational changes in extracellular loops of the receptor that may serve to promote vectorial transport of siderophore. In addition, we have identified a novel, cyanocobalamin-independent interaction between TonB and BtuF. This interaction could serve to situate BtuF to efficiently encounter, bind and deliver substrate for uptake into the cytoplasm. === L'acquisition d'éléments nutritifs par les bactéries gram-négatives nécessite des stratégies de transport au travers de la membrane externe. Le fer étant un élément essentiel pour les bactéries, nous travaillons à élucider le mécanisme moléculaire de ce transport. === En milieu aérobique, le fer se trouve principalement sous sa forme ferrique qui est peu soluble. Pour surmonter cet obstacle, les bactéries importent des sidérophores, un type de chélateurs du fer ferrique. L'acquisition des ces sidérophores implique leur liaison par un récepteur de la membrane externe et par une protéine périplasmique de liaison. L'énergie nécessaire au transport de sidérophores à travers la membrane externe pourrait être fournie par TonB, une protéine de la membrane cytoplasmique qui se lie à la face périplasmique du récepteur de la membrane externe. === Pour étudier le mécanisme moléculaire du transport TonB-dépendant, nous nous sommes attardés aux changements de conformation que FhuA, le récepteur de sidérophores hydroxamiques situé dans la membrane externe, subit en réponse à sa liaison avec TonB. Des épitopes pour anticorps monoclonaux contre FhuA ont été sélectionnés et leur liaison avec FhuA, en présence et en absence de TonB, a été testée. Les changements les plus notables ont été remarqués avec les anticorps se liant aux boucles extracellulaires de FhuA. Pour confirmer ces changements, un fluorophore, le MDCC, a été conjugué aux boucles externes de FhuA et l'intéraction entre les deux protéines engendre une extinction de fluorescence. === En étudiant d'autres étapes du transport TonB-dépendant, des intéractions entre TonB et FhuD, une protéine périplasmique de liaison de sidérophores hydroxamiques, ont été découvertes. Pour vérifier si des intéractions similaires existaient dans d'autres systèmes d'acquisition TonB-dépendant, nous avons investigué les intéractions entre TonB et BtuF, la protéine périplasmique de liaison de la cyanocobalamine. L'identification, par phage display, de résidus clés sur TonB et BtuF nous a permis de prédire une intéraction entre ces deux protéines, que nous avons confirmée par la suite in vitro. La stoechiométrie de liaison a été établie à 1 :1 et est indépendante de la présence de cyanocobalamine. === En conclusion, la liaison de TonB à la face périplasmique de FhuA induit des changements de conformation dans les boucles extracellulaires du récepteur qui pourraient servir au transport unidirectionnel de sidérophores. De plus, nous avons découvert une nouvelle intéraction entre TonB et BtuF qui est indépendante de la présence de cyanocobalamine. Cette intéraction positionnerait BtuF de façon à maximiser la rencontre, la liaison et le transport de son substrat jusqu'au cytoplasme.