Biochemical and functional characterization of connecdenn and its DENN domain in intracellular trafficking

• Main Author: Allaire, Patrick
• Other Authors: Peter Scott McPherson (Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2009
• Subjects: Biology - Neuroscience
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=66644

Endocytosis and vesicle trafficking are essential for cellular division, differentiation and survival. Following endocytosis, cargo is delivered to the sorting endosome, where it is selected for degradation or recycled back to the cell surface. The various trafficking steps within the endosomal system are regulated by Rabs, small GTPases, which toggle between an inactive GDP-loaded conformation and an active GTP-loaded conformation. Clathrin-mediated endocytosis (CME) allows cargo internalization and coupling to the endosomal system via formation of clathrin-coated vesicles (CCVs). Connecdenn was identified as a component of clathrin-coated vesicles (CCVs) isolated from developing rat brain. The C-terminus of connecdenn is predicted to be unstructured and encodes several binding motifs that bind to the CME proteins intersectin1, endophilinA1 and AP-2. Connecdenn is enriched in brain, localizes to synapses, and its knockdown in hippocampal cultures inhibits synaptic vesicle recycling. Connecdenn enriches strongly on CCVs and is stably associated with the CCV membrane after removal of its clathrin coat. The stable membrane association of connecdenn depends on the N-terminal DENN domain, an evolutionary conserved but uncharacterized tri-partite domain. The DENN domain also functions as a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for Rab35, which regulates cargo recycling. In fact, in non-neuronal cells, connecdenn and Rab35 do not regulate CME but control the recycling of cargo from sorting endosomes. Curiously, connecdenn/Rab35 specifically control the recycling of MHCI, which enters the cell independently of CME but do not influence the trafficking of the transferrin receptor, a prototypical CME cargo. Overall, my thesis work on connecdenn has allowed us to appreciate three important conclusions. First, connecdenn is a CCV protein that functions at the neuronal synapse to regenerate SVs. Second, connecdenn === Le trafic intracellulaire est un processus essentiel pour la division, différenciation et survie cellulaire. Suite à l'endocytose, le cargo est acheminé vers l'endosome de triage qui le dirigera vers la voie de dégradation ou le recyclera à la surface de la cellule. Le trafic endosomal est régi par les petites GTPases Rab, basculant entre la conformation inactive GDP-chargé et active GTP-chargé. Dans l'endocytose tributaire pa r la clathrine (ETC), la formation de vésicules tapissées de clathrine (VTC) permet l'internalisation du cargo et son couplage au système endosomal. La protéine Connecdenn a été identifiée comme composante des VTCs. L'extrémité C-terminale de Connecdenn est prédite etre non structurée et code plusieurs motifs d'interaction avec les protéines impliquées dans l'ETC comme intersectin1, endophilinA et AP-2. Connecdenn est enrichie sur les VTCs. Lorsque le manteau de clathrine est dissocié, l'association de Connecdenn avec la membrane des VTC demeure stable. Cette association et son recrutement dans les VTCs s'effectuent grâce à son extrémité C-terminale et s'avèrent nécessaires pour le recyclage des vésicules synaptiques. Par contre, l'association de Connecdenn avec la membrane des VTCs dépend de son domaine DENN N-terminal, dont la fonction n'a pas encore été caractérisée. Ce domaine fonctionne également comme un facteur d'échange guanine (FEG). En fait, dans les cellules non-neuronales, Connecdenn et Rab35 ne régularisent pas l'ETC, mais plutôt le recyclage du cargo à partir des endosomes de triage. De plus, l'épuisement de Connecdenn ou Rab35 perturbe spécifiquement le recyclage de MHCI, dont l'internalisation n'est pas régie par l'ETC. Toutefois, l'absence de Connecdenn ou de Rab35 n'a aucune influence sur le trafic du récepteur de la transferrine, cargo typique de l'ETC. Mon travail sur Connecdenn se résume a trois conclusions generales;