Proteomics analysis of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus

• Main Author: Gilchrist, Annalyn
• Other Authors: John J M Bergeron (Supervisor1)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2008
• Subjects: Biology - Cell
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=18715

Isolated rough and smooth microsomes of the endoplasmic reticulum and isolated Golgi apparatus from rat liver were analyzed by proteomics using mass spectrometry, identifying 1064 proteins among the three fractions. An additional 598 proteins were identified by biochemically subfractionating the rough and smooth microsomes by treatment with a high salt wash and the detergent Triton-X 114. Proteins were quantified by redundant peptide counts which enabled an assessment of the extent of cross-contamination between the endoplasmic reticulum and Golgi fractions and other organellar contamination. Results of this analysis revealed that the Golgi fraction was contaminated up to 30% by proteins of the endoplasmic reticulum and that the mitochondria constitute the largest source of organellar contamination for all three fractions. Hierarchical clustering of the distribution profiles of proteins among the three fractions assigned proteins to either the rough and/or smooth endoplasmic reticulum or the Golgi apparatus. In doing so, the protein disulphide isomerase, ERp44, was localized to the Golgi. This result was verified by immunolocalization with an ERp44 antibody. Furthermore, hierarchical clustering assigned a location for 176 previously uncharacterized proteins in the endoplasmic reticulum providing a subcellular context to their putative functions predicted by bioinformatics. Additionally, the biochemical subfractionation of the rough and smooth microsomes assigned proteins to the cytosolic, membrane or luminal subcompartments of the endoplasmic reticulum. These results guided the selection of uncharacterized membrane proteins for further characterization leading to the identification of 7 proteins upregulated by ER stress, which included 4 new molecular chaperones. Finally, a comparison of this work with previous proteomics analyses of these organelles showed that the proteomes of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus presented here may be the mo === L'analyse par protéomique des microsomes du Réticulum Endoplasmique rugueux, des microsomes du Réticulum Endoplasmique lisse et de l'appareil de Golgi a permis l'identification de 1064 protéines par spectrométrie de masse. Par ailleurs, le fractionnement biochimique des microsomes lisses et rugueux par lavage avec une solution saline concentrée suivi d'un traitement au détergent Triton X-114 a permis l'identification de 598 nouvelles protéines. Les protéines furent quantifiées en fonction du nombre de peptides identifiés par spectrométrie de masse. La quantification des protéines a permis d'évaluer le degré de contamination croisée présent dans les fractions du Réticulum Endoplasmique, de l'appareil de Golgi et celui provenant des autres organelles. Les résultats de cette analyse ont révélé que la fraction de Golgi était contaminée jusqu'à un maximum de 20% par les protéines provenant du Réticulum Endoplasmique et que les mitochondries constituaient la source essentielle de contamination dans ces trois fractions. La clustérisation hiérarchique des protéines quantifiées a permis de dresser le profile de distribution des différentes protéines et ainsi de les assigner au sein des différents compartiments, à savoir aux microsomes du Réticulum Endoplasmique rugueux et/ou lisses, ou alors à l'appareil de Golgi. De ce fait, la protéine disulphide isomerase, ERp44, a été localisée dans l'appareil de Golgi. Ce résultat a été confirmé par immunolocalisation avec l'anticorps ERp44. Par ailleurs, cette même clustérisation hiérarchique a permis de localiser pour la première fois 176 protéines dans le Réticulum Endoplasmique correspondant ainsi à leur fonction putative prédite par bioinformatique. De plus, le fractionnement biochimique des microsomes lisses et rugueux a permis d'assigner les protéines dans les compartiments subcellulaires du Réticulum Endoplasmique : cytosol, membrane ou lumière. Ces résultats ont é