Effects of antiretroviral drugs on the translocation status of Human Immunodeficiency Virus type 1 reverse transcriptase

• Main Author: Marchand, Bruno
• Other Authors: Matthias Gotte (Internal/Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2007
• Subjects: Biology - Microbiology
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=18278

The reverse transcriptase of the Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) is responsible for transcribing the viral single-stranded RNA genome into double-stranded DNA. Due to its vital role in the viral life cycle, it is often targeted in the treatment of HIV-1 infected patients. Inhibitors that block the reverse transcriptase enzyme were shown to interfere with nucleotide incorporation. At the end of a nucleotide incorporation cycle, the newly incorporated substrate is still located in the nucleotide binding site. In order to continue the elongation of the DNA chain, the enzyme has to move by one nucleotide relative to the nucleic acid template to free the nucleotide binding site. This movement is referred to as translocation. Translocation is extremely rapid and is therefore kinetically invisible. In order to study the mechanism of translocation, I developed site-specific footprinting assays with a resolution of a single nucleotide, which allowed us to detect the precise positioning of the reverse transcriptase on a DNA template. Using these techniques, in combination with kinetic analysis as well as other enzymatic assays, I studied the translocational status of the reverse transcriptase in various conditions, and concluded that this enzyme translocates according to a “Brownian ratchet model”. In this model, the enzyme oscillates between pre- and post-translocated positions and the nucleotide substrate traps the post-translocational state. I identified important factors that affect the translocational equilibrium: the sequence of the nucleic acid template, the nature of the nucleotide at the 3’ end of the primer, the presence of mismatches in the double-stranded nucleic acid substrate, the presence of nucleotides, the presence of inhibitors, the nature of these inhibitors, the presence of drug resistance conferring mutations and the temperature are parameters that have all been shown to modify the translocational equilibrium of the reverse === La transcriptase inverse du Virus d’Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la transcription du génome viral composé d’ARN simple brin en ADN double brin. Étant donné son rôle vital dans le cycle viral, cet enzyme est une cible de choix pour le traitement des patients infectés par le VIH-1. Les inhibiteurs qui bloquent la transcriptase inverse affectent régulièrement l’incorporation des nucléotides. Après l’incorporation d’un nucléotide, ce dernier est toujours situé dans le site de liaison des nucléotides. Afin de libérer ce site, la transcriptase inverse doit se déplacer d’un nucléotide par rapport à la matrice d’acide nucléique, déplacement que nous appelons la translocation. Celle-ci est un mouvement très rapide qui est cinétiquement invisible. Afin d’étudier le mécanisme de translocation, j’ai dévelopé des tests d’empreinte moléculaire ayant une résolution d’un seul nucléotide nous permettant de détecter la position précise de l’enzyme sur une matrice d’ADN. En utilisant ces tests, en combinaison avec des analyses cinétiques et autres expériences enzymatiques, j’ai étudié le statut translocationel de la transcriptase inverse, et nous en sommes venus à la conclusion que cet enzyme se déplace selon un modèle dans lequel un mouvement Brownien est responsable du déplacement de l’enzyme. Celui-ci est stabilisé par la liaison d’un nucléotide dans le stade post-translocationel. J’ai identifié des facteurs importants influençant la translocation : la séquence de la matrice d’acide nucléique, la nature du nucléotide à l’extrémité 3’ de l’amorce, la présence d’erreurs d’association dans le substrat d’acide nucléique double brin, la présence de nucléotides, la présence d’inhibiteurs, la nature de ces inhibiteurs, la présence de mutations conférant une résistance aux médicaments et la température ont tous été démontrés comme mod