Structure-function analysis of the prosegment and the cysteine-rich domain of the proprotein convertase PC5A: its interaction with TIMP-2

• Main Author: Nour, Nadia
• Other Authors: Nabil G. Seidah (Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2004
• Subjects: Chemistry > Biochemistry
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=18202

The mammalian proprotein convertases (PCs) of the secretory pathway are calcium-dependent serine proteinases related to bacterial subtilisin and yeast Kexin. As Kexin and subtilisin, all basic aa-specific convertases contain a comparable N-terminal structure starting with a signal peptide followed by a prosegment and a conserved catalytic domain. The convertases possess additional domains at their C-terminus following the catalytic domain. All PCs exhibit a P-domain prior to the C-terminal architecture, which is specific to each convertase. Three of the basic-aa-specific convertases, furin, PACE4 and PC5 display the presence of a Cysteine-rich domain (CRD). The function of the CRD has not been studied extensively and remains unclear whereas the inhibitory function of the prosegments has been investigated previously. In this manuscript, both the function of the prosegment and the CRD of PC5A were investigated as very little was known about the zymogen activation of PC5A, the inhibitory role of its prosegment and the characterisation of the function of its CRD. Previous subtilisin- and furin-based studies demonstrated that the prosegment acts as an intramolecular chaperone and as a potent inhibitor of its cognate enzyme. From these results, the inhibitory function of the prosegment of PC5A was investigated. The data revealed that the prosegment of PC5 is a potent inhibitor in vitro and ex vivo of its parent enzyme, but is not selective. Introduction of single point mutations within the prosegment did not increase the potency or the selectivity of the inhibitor. We next characterised the relevance of the CRD of PC5A as it implication in the cell surface localisation of the enzyme. The plasma membrane retention was demonstrated to be via the interaction of the CRD of PC5A with TIMP-2, an endogenous MMP inhibitor. This study also showed that PC5A may have an anti-proliferative role as its overexpression diminishes cell proliferation while its inactivation by siRNA cau === Les convertases des proprotéines qui résident dans la voie de sécrétion sont des serine protéases de mammifères, apparentées par leur structure aux subtilisines bactériennes et à l’enzyme de la levure kexine. Comme ceux-ci, les convertases possèdent un peptide signal, un segment pro et une région catalytique conservée. De plus, ces protéases possèdent deux domaines supplémentaires, appelés domaines P et C-terminal qui sont absents chez les subtilisines mais présents chez la kexine. Le domaine C-terminal est unique à chaque convertase. Trois membres de la famille des convertases, furine, PACE4 et PC5 démontrent la présence d’un domaine riche en cysteine (CRD). La fonction de ce domaine ne fut jamais sérieusement étudiée et demeure inconnue, toutefois, l’activité inhibitrice du segment pro de la subtilisine ainsi que de certaines convertases furent étudiées extensivement auparavant. Dans ce mémoire, la fonction du segment pro ainsi que du domaine riche en cysteine de PC5A furent étudiées. Des études précédentes sur la subtilisine et la furine ont demontrées que le segment pro agit à la fois de chaperone et d’inhibiteur de l’enzyme parental. Inspirée de ces études, la fonction inhibitrice du segment pro de PC5 fut investiguée et révéla que ce domaine est un inhibiteur puissant de PC5 in vitro et ex vivo, cependant l’inhibition n’est pas spécifique à une seule convertase. De plus, des mutations ponctuelles introduites dans la région pro n’ont augmenté ni la puissance, ni la spécificité de l’inhibiteur. Auncune fonction du CRD n’avait été définie chez les PCs. Ce domaine joue un rôle important dans la localisation de l’enzyme puisqu’il permet à PC5A d’être retenu à la surface cellulaire. Sans ce domain riche en cysteine, PC5A n’est plus retrouvée à la surface car c’est au niveau de ce domaine que PC5A interragit avec TIMP-2 qui se trouve à la surface cellulaire. De plus, la surexpress