The identification and characterization of EWS as a telomerase-associated protein

• Main Author: Kwan, Ricky
• Other Authors: Chantal Autexier (Internal/Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2014
• Subjects: Biology - Cell
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=121410

Telomerase is a ribonucleoprotein complex responsible for immortalizing 85% of all human malignant tumors, making telomerase regulation a very attractive target for the development of anti-cancer therapeutics. Thus far, many proteins have been identified that regulate human telomerase biogenesis, activity, trafficking, recruitment and degradation. By comparison, there have been very few proteins identified to associate with mouse telomerase. Due to the importance of mouse models in the development of anti-cancer therapeutics, investigation of mouse telomerase-associated proteins is required to establish a detailed understanding of the species-specific differences between mouse and human telomerases and telomeres. Moreover, understanding telomerase and telomere regulation in mouse and human cells may inform us regarding the differential response to telomerase inhibition and telomere dysfunction that has been observed between human and mouse cells. In search for novel proteins associated with mouse telomerase reverse transcriptase (mTERT), the catalytic subunit of telomerase, we introduced an expression vector encoding a dually-tagged Protein G and streptavidin binding peptide (SBP)-mTERT in NIH3T3 cells and we performed SBP-mediated telomerase purification followed by mass spectrometry. We identified the Ewing's sarcoma protein (EWS) as a putative telomerase-associated candidate. We validated the interaction between EWS and human TERT (hTERT) and report that EWS indirectly binds to the active telomerase under physiological levels of hTERT and EWS, and this interaction is not dependent on human telomerase RNA (hTR), DNA, or RNA. Moreover, we present preliminary evidence suggesting that EWS may also directly bind hTR. Finally, we show that knockdown of EWS in HeLa cells does not affect cell growth, but it remains possible that EWS may be a negative regulator of telomerase and telomere length. === La télomérase est un complexe ribonucléoprotéique responsable de l'immortalisation de 85% des tumeurs malignes humaines, faisant de sa régulation une excellente cible pour le développement de traitements contre le cancer. A ce jour ont été identifiées de nombreuses protéines régulant la biogénèse, le transport, l'activité, le recrutement et la dégradation de la télomérase humaine. A titre de comparaison, peu de protéines ont été identifiées comme associées à la télomérase murine. Mais en raison de l'importance des modèles murins dans le développement de traitements du cancer, la recherche de telles protéines murines est requise pour une compréhension détaillée des différences inter-espèces des télomérases et des télomères humains et murins. De plus, le décryptage de la télomérase et de la régulation des télomères chez l'homme et la souris nous permettra de mieux apprécier les différences de réponse à l'inhibition et à la dysfonction télomèrique observées entre les cellules des deux espèces. Afin de trouver de nouvelles protéines associées à la sous-unité catalytique de la télomérase murine, la transcriptase-inverse (mTERT), nous avons introduit dans des cellules NIH3T3 un vecteur d'expression codant mTERT couplée à deux marqueurs : proteine G et peptide de liaison à la streptavidine (SBP). Nous avons ensuite réalisé une purification de la télomérase via SBP puis soumis les complexes à la spectrometrie de masse. Nous avons identifié la protéine du sarcome d'Ewing (EWS) comme candidat potentiel associé à la télomérase. L'intéraction entre EWS et TERT humain (hTERT) a été validée et nous avons montré que l'intéraction avec la télomérase active est indirecte, que cette intéraction n'est pas dépendante du composant ARN (hTR) de la télomérase humaine, de l'ADN ou de l'ARN. De plus, nous présentons des résultats préliminaires suggérant une liaison directe entre EWS et hTR. Enfin, nous montrons que l'inhibition de l'expression de EWS dans les cellules HeLa n'impacte pas la croissance cellulaire. EWS pourrait être un régulateur négatif de la télomérase et de la taille des télomères.