| Summary: | Receptor tyrosine kinases (RTKs) are transmembrane cellular receptors that respond to growth factor stimulation and promote cellular proliferation in normal biological processes, such embryogenesis and wound healing. RTK activation and signalling are tightly regulated processes; their dysregulation promotes unrestrained cellular proliferation and is associated with cancer initiation and progression. As such, RTKs are targets of many therapeutic strategies for the treatment of cancer. However, despite initial success, both innate and acquired resistance hinders the efficacy of many of these inhibitors. Active signalling by the Met RTK plays a role in melanomas, osteosarcomas, breast carcinomas, gliomas, non-small cell lung cancers (NSCLC), and cancers of the gastro-intestinal (GI) tract. Multiple mechanisms of Met oncogenic activation have been identified, including autocrine/paracrine stimulation, Met overexpression, genomic amplification, point mutation and alternative splicing. Inhibitors of Met are currently in all phases of clinical trials for multiple tumour types, thus there exists a need to better understand the mechanisms through which Met promotes tumourigenesis, and how cells respond to Met inhibitors, and how resistance can occur.In my thesis, I establish that in four different MET-amplified gastric cancer cells there is a Met-dependent loss of its negative regulator, the E3 ligase, Cbl. I utilized structure-function analysis to demonstrate that this loss of Cbl levels requires Met kinase activity, Cbl E3 ligase activity, and recruitment of Cbl to Met. Where Met is active, Cbl is recruited and subsequently ubiquitinated, and degraded through the proteasome. I also observed that EGFR, which is also negatively regulated by Cbl, is less efficiently degraded upon stimulation in the presence of active Met and low Cbl levels. Thus, I demonstrate that Met-driven Cbl loss not only promotes dysregulation of Met, but of other Cbl target proteins as well.As much of what is known with respect to Met signalling has been identified in the context of activation by its ligand, hepatocyte growth factor (HGF), I investigated the Met-dependent pathways and transcriptional program in gastric cancer cells where Met is chronically active via amplification. I observed that activation of the Ras/Mek/Erk, PI3K/AKT and STAT3 pathways all require Met kinase activity, with STAT3 signalling required for Met-dependent cell proliferation. Interestingly, upon treatment with Met inhibitor, Erk becomes reactivated at later time points (16-24h) in 2/4 cell lines tested. This correlated with loss of Erk negative regulators, DUSP4 and DUSP6, upon Met inhibition. Dual inhibition of Met and Mek decreased cell viability as compared to inhibition of either alone. Hence loss of Erk negative regulators upon Met inhibition, allows for reactivated Erk to promote cell survival and may contribute to innate resistance to targeted Met therapeutics. Next, I established Met inhibitor-resistant cells and utilized gene and protein expression arrays to identify the mechanisms of resistance. I observed that resistant cells were still MET-amplified, but Met kinase activity remained inhibited. Met-independent cell proliferation is, in part, mediated by Erk signalling. Further, I also provide evidence that cell survival signals, in the presence of Met inhibition, may be mediated by a mesenchymal-to-epithelial transition. Altogether, the reactivation of Erk signalling under conditions of innate and acquired resistance to Met inhibitors suggests that combinatorial therapy targeting both Met and Mek may lead to better efficacy and response. === Les récepteurs à activité kinase (RTK) sont des protéines transmembranaires situées à la surface des cellules qui, une fois activés par des facteurs de croissance, induisent la prolifération cellulaire durant des processus biologiques normaux. La signalisation par les RTKs est un processus devant être hautement régulé étant donné qu'une signalisation aberrante des RTKs induit une prolifération cellulaire incontrôlée typique au développement et à la progression de tumeurs. Les RTKs constituent donc une cible thérapeutique de choix pour le traitement du cancer et plusieurs inhibiteurs de RTKs sont maintenant utilisés en clinique. Par contre, malgré des résultats initiaux prometteurs, il appert que de multiples tumeurs développent des mécanismes de résistance aux inhibiteurs de RTKs. Le RTK Met joue un rôle important dans de multiples cancers. Plusieurs mécanismes d'activation oncogénique du récepteur Met ont été identifiés. Des inhibiteurs de Met sont présentement testés en essais cliniques pour le traitements du cancers. Il est donc essentiel de mieux comprendre comment le RTK Met promeut la formation de tumeurs, comment les cellules cancéreuses répondent aux traitements ainsi que les mécanismes de développement de résistance aux inhibiteurs. Dans cette thèse, j'établis que dans des lignées de cellules cancéreuses gastriques où le gène MET est amplifié, il y a une perte de la protéine ligase E3 Cbl qui est un inhibiteur de Met. À l'aide d'une analyse structurelle et fonctionnelle, je démontre que cette perte de Cbl requière l'activité kinase de Met, l'activité ligase de Cbl et le recrutement de Cbl à Met. L'activation de Met mène au recrutement de Cbl, à son ubiquitination et sa dégradation via le protéasome. J'ai observé que le RTK EGFR, qui est aussi régulé négativement par Cbl, est moins efficacement dégradé suite à sa stimulation en présence d'un récepteur Met actif et de bas niveaux de Cbl. Ainsi, je démontre que la perte de Cbl suite à l'activation de Met mène à la dérégulation de Met, ainsi que d'autres cibles de Cbl.Étant donné que la majorité de ce qui est connu concernant la signalisation en aval de Met a été étudiée dans le contexte de l'activation du RTK par son ligand, le facteur de croissance hépatocytaire HGF, j'ai décidé d'étudier les signaux et programmes de transcription activés en aval de Met quand le récepteur est activé de manière chronique, suite à son amplification. J'ai observé que l'activation des voies de signalisation Erk, AKT et STAT3 requièrent toutes l'activité kinase Met, la signalisation par STAT3 contribuant à la prolifération cellulaire. Curieusement, suite au traitement des cellules cancéreuses avec un inhibiteur de Met, Erk devient réactivé à des temps subséquents (16-24h) dans deux des quatre lignées cellulaires analysées. Ceci corrobore avec la perte des régulateurs négatifs de Erk, DUSP4 et DUSP6, suite à l'inhibition de Met. L'inhibition combinée de Met et Mek diminue la viabilité cellulaire comparée à l'inhibition de Met ou Mek seulement. Par conséquent, la perte des régulateurs négatifs d'Erk suite à l'inhibition de Met permet la réactivation d'Erk et la survie des cellules, et peut contribuer à la résistance innée de certaines cellules cancéreuses aux inhibiteurs de Met.Suite à ces résultats, j'ai établi des lignées cellulaires résistantes à un inhibiteur de Met et analysé l'expression des gènes et protéines à l'aide de matrices pour identifier les mécanismes de résistances. J'ai observé que le gène MET est toujours amplifié dans les cellules résistantes, mais que l'activité kinase reste inhibée en présence de l'inhibiteur. La prolifération cellulaire indépendante de Met est en partie assurée par Erk. Sur la base de ces résultats, la réactivation de la voie de signalisation Erk dans des conditions de résistance innée ou acquise aux inhibiteurs de Met implique qu'une thérapie combinatoire ciblant Met et Mek puisse être plus efficace que les monothérapies.
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