Monitoring transcription in mouse oocytes and early embryos

• Main Author: Edwards, Nicole
• Other Authors: Hugh Clarke (Internal/Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2014
• Subjects: Biology - Cell
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=121331

The growth of an oocyte, the female germ cell, its fertilization, and its subsequent development as an embryo are complex and highly regulated processes leading to the successful growth of a fetus to term. Regulation of gene expression is vital to the developmental success of oocytes and embryos. The expression pattern of certain genes can be monitored using genetic strategies such as the generation of transgenic reporter mice. Previous work has shown that a T-Cell Factor/Lymphoid Enhancing Factor-responsive (TCF/Lef-responsive) LacZ reporter monitors aspects of murine implantation embryo development and cellular dynamics in adult tissues. We aim to characterize the pattern of reporter activity and determine the mechanism of its regulation in oocytes and preimplantation embryos by using TCF/Lef-LacZ mice and the highly sensitive β-galactosidase substrate fluorescein-di-galactoside (FDG). We first show that reporter activity is present in oocytes during mid-growth and absent in fully grown oocytes. Reporter activity is detectable at the late 2-cell embryo stage and remains detectable in all blastomeres until the 4-cell stage. Reporter activity becomes restricted to the mural trophectoderm in late blastocysts. In blastocyst outgrowths, reporter activity is selective to areas of the inner cell mass growth. Immunofluorescent detection of total β-Catenin shows no nuclear localization in mid-growth oocytes, indicating β-Catenin/TCF-independent activation of the reporter. We then show through gene expression analysis, nucleotide incorporation, imaging, and inhibitor experiments that the TCF/Lef-LacZ reporter requires active transcription in the oocyte and early embryo. We show that activation of reporter expression in oocytes and preimplantation embryos is β-Catenin/TCF-independent and suggest that the reporter is possibly under the influence of cis-regulatory elements near the transgenic insertion site in the genome. As FDG-staining maintains oocyte and embryo viability and survival in culture, the TCF/Lef-LacZ reporter has the potential application as a reporter of oocyte- and/or embryo-specific genes, and a prospective biological marker of oocyte and embryo quality. === La phase de croissance d'un ovocyte, sa fécondation, et son développement, pour aboutir à un embryon préimplantatoire, sont des processus complexes et hautement controlés pour permettre la croissance du fœtus jusqu'au terme. La régulation de l'expression des gènes doit se faire correctement et est essentielle pour l'acquisition de la compétence développemental. Le profil d'expression de certains gènes peut être monitoré grâce à des stratégies génétiques, comme avec l'utilisation de souris transgéniques. Des travaux précédents ont montré que le gène rapporteur TCF/Lef-LacZ (gène LacZ réagissant au complexe T-Cell Factor/Lymphoid Enhancing Factor) permet de monitorer certains aspects de l'implantation embryonnaire chez la souris, son développement et de certaines dynamiques cellulaires dans des tissus de souris adultes. Nous cherchons à caractériser le profil d'activité de ce gène rapporteur et à déterminer le mécanisme de sa régulation dans les ovocytes et les embryons préimplantatoires, en utilisant des souris transgéniques TCF/Lef-LacZ et la fluorescéine-di-galactoside (FDG), qui est un substrat très sensible à la béta-galactosidase. Dans un premier temps, nous montrons que l'activité de ce gène rapporteur est présente dans les ovocytes en croissance mais absente dans les ovocytes ayant atteint leur taille maximale. Cette activité reprend au stade tardif de 2 cellules chez l'embryon persistant dans tous les types de cellules jusqu'au stade de blastocyste E4.5 où elle se restreint au trophectoderme mural. Nous montrons que son activité, dans les blastocystes implantés in vitro, est spécifique de certaines zones de la masse cellulaire interne. La détection de la fluorescence via immunologie de la β caténine totale ne demontre aucune localization nucléaire dans les ovocytes à la mi-phase de croissance; ce qui nous indique que l'activation du rapporteur est indépendante de celle de la voie β caténine/TCF. Par la suite, nous montrons par l'analyse de l'expression des gènes, l'incorporation de nucléotides, l'imagerie, la mise en place d'inhibiteurs au cours des expériences, que le gène TCF/Lef-LacZ est soumis à une régulation transcriptionnelle. Ceci suggère que l'activation de l'expression de ce gène rapporteur dans les ovocytes et les embryons préimplantatoires est indépendante de la voie β caténine/TCF et possiblement sous l'influence d'éléments cis-régulatoires près du site d'insertion transgénique dans le génome. Le gène rapporteur TCF/Lef-LacZ pourrait donc être le rapporteur de gènes spécifiques dans l'ovocyte et/ou l'embryon et un marqueur biologique prospectif de la qualité de l'embryon.