| Summary: | Spliced-leader (SL) trans-splicing is a splicesomal process by which the 5'-ends of diverse mRNAs are replaced by a common sequence originating from a specialized SL donor RNA. The patchy phylogenetic distribution of SL trans-splicing, including its recent discovery in the deuterostomes in the tunicate Ciona intestinalis presents two equally possible evolutionary histories. Either it is an ancestral eukaryotic trait that has been lost in multiple lineages, or, it was invented de novo in various lineages including the tunicates. SL trans-splicing has a known function in the resolution of polycistronic operons. However, for monocistronic transcripts there are many proposed but not substantiated functions, including the 5'-untranslated region (5'-UTR) sanitization hypothesis. I investigated the phylogenetic distribution of SL trans-splicing in the deuterostomes and its possible function as a 5'-UTR sanitization mechanism in the monocistronic troponin I gene (CiTnI) in Ciona. I produced oligo-capped 5'-RACE cDNA libraries to survey mRNA 5'-end sequences for common candidate SL sequences in the cephalochordate Branchiostoma, the hemichordate Saccoglossus and the echinoderm Strongylocentrotus. Following steps taken to eliminate short primer-related sequences created during the 5' oligo-capping reaction, and apparently hidden in the form of heteroduplex complexes, the cDNA libraries were subjected to 454 ultra high-throughput sequencing. Several indicators, including the presence of 5'-TOP sequences at the 5'-termini of mRNAs encoding ribosomal proteins and translation factors showed that the 5'-RACE libraries effectively represented the extreme 5'-termini of mRNAs. No common 5'-ends that could represent SL sequences were observed in any of the species examined. This result strongly supports the independent evolution of SL trans-splicing in the tunicates. To further examine the postulated functional role of SL trans-splicing in removing deleterious sequences from the 5'-UTR, I made and used an internal transfection control construct to validate the observation, previously made in our lab, that an experimental CiTnI reporter construct with a long retained-outron 5'-UTR showed low reporter gene activity when electroporated in Ciona embryos. I then created a new CiTnI construct to directly assess the possible presence of a specific deleterious element in the long retained-outron 5'-UTR. My results clearly indicated that there is no specific deleterious element, but that it is the length of the retained-outron 5'-UTR, per se, that leads to low TnI reporter construct expression. === Le “spliced-leader” (SL) trans-épissage est un processus dépendant du spliceseome dont l'éxtremité 5' de divers ARNms sont remplacés par une séquence commune dérivant d'un SL ARN donneur spécialisé. À cause de sa répartition phylogénétique compliquée et sa découverte récente dans le tunicier Ciona intestinalis, un deutérostomiens, il existe deux possibilités d'évolution plausible pour le SL trans-épissage. Le SL trans-épissage est soit; un caractère ancestral qui s'est perdu plusieurs fois dans différentes lignées où il s'est inventé de novo dans différentes lignées, y compris les tuniciers. Une des fonctions connues du SL trans-épissage est la résolution de transcrits polycistroniques, cependant sa fonction concernant les transcrits monocistroniques est moins évidente. Il existe plusieurs hypothèses en ce qui concerne la fonction du SL trans-épissage de gènes monocistroniques, une d'entre-elles est l'assainissement des régions 5' non-traduit (5'-UTR). Mes travaux de recherche ont portés sur la répartition phylogénétique de SL trans-épissage dans les deutérostomiens et sa fonction en tant d'assainissement de la région 5' non-traduite pour le gène troponine I (CiTnI) de Ciona. J'ai créé des banques d'ADNc 5'-RACE coiffés d'oligonucleotide pour bien étudier les séquences à l'extrémité 5' de différents ARNms et ainsi découvrir un motif SL commun dans le Branchiostoma céphalochordé, le Saccoglossus hemichordate et le Strongylocentrotus échinodermes. Après avoir éliminé les courtes séquences reliées à l'amorce qui se sont crée au cours de la réaction de coiffe des ARNs et qui étaient apparemment cachées sous forme de complexes hétéroduplexes, les banques d'ADNc ont été soumises au séquençage 454 ultra à haut débit. La présence des séquences 5'-TOP sur les ARNms des proteines ribosomique et gènes de facteurs de traduction était un des indicateurs confirmant que les banques comprenaient des extrémités 5' de ARNm de qualité. Des extrémités 5' en communs, qui pourraient représenter des séquences SL, n'ont pas été observées dans les organismes examinés. Ce résultat appuie fortement l'évolution indépendante de SL trans-épissage dans les tuniciers.Pour examiner davantage le rôle d'élimination des séquences néfastes de la 5'-UTR postulé pour le SL trans-épissage, j'ai produit et utilisé un contrôle interne de transfection. Ce contrôle a été construit afin de valider des résultats obtenus il y a quelques années dans notre laboratoire, qu'un rapporteur expérimental de CiTnI qui contient un outron-5'-UTR non-épissé a une faible activité du gène rapporteur lorsqu'électroporé dans des embryons de Ciona. Ensuite, j'ai créé un nouveau rapporteur CiTnI pour évaluer la présence possible d'un élément néfaste dans la séquence du 5'-UTR. Mes résultats indiquent qu'il n'y a aucun élément néfaste spécifique, mais que la longueur du outron-5'-UTR retenu, en soi, mène à la faible expression du rapporteur TnI.
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