Foxl2 regulation and function in gonadotropes

• Main Author: Tran, Stella Lê Minh
• Other Authors: Daniel Bernard (Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2013
• Subjects: Biology - Physiology
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=116978

Pituitary follicle-stimulating hormone (FSH) is crucial for mammalian reproduction; it regulates gametogenesis and gonadal function. We know that impaired FSH production may leads to infertility, yet the mechanisms controlling FSH synthesis are poorly understood. Intra-pituitary activins stimulate FSHβ subunit (Fshb) gene transcription in gonadotrope cells, the rate-limiting step in FSH hormone synthesis. Studies conducted in immortalized gonadotrope cells indicate that activin A-stimulated Fshb gene transcription is dependent on homologs of Drosophila mothers against decapentaplegic (SMAD) proteins. More recently, the transcription factor forkhead box L2 (FOXL2) was reported to stimulate SMAD/activin A-induced Fshb transcription. Here, I focused on elucidating the mechanisms underlying Foxl2 regulation and function in gonadotrope cells. First, I demonstrated that overexpression of FOXL2 and SMAD 2, 3, and 4 confers activin-responsiveness to the murine Fshb promoter in heterologous cells. Upon activin A induction, FOXL2 synergizes with SMAD proteins to activate the Fshb promoter; this cooperation requires binding of both FOXL2 and SMAD3 (or SMAD4) to DNA. I showed that SMAD3-induction of the Fshb transcript is dependent on endogenous FOXL2 in homologous cells. I identified a proximal putative forkhead binding elements (FBE) and an adjacent SMAD binding element (SBE), that are crucial for FOXL2/SMAD3 induction of murine Fshb promoter-reporter activity. Based on previous data and my results, I propose a model where activins stimulate formation of FOXL2-SMAD2/3/4 complexes that drive murine Fshb transcription by binding to a conserved composite SBE/FBE element within the proximal promoter. FOXL2 plays a critical role in activin A-stimulated murine Fshb transcription in vitro. Next I tested the hypothesis that FOXL2 is required for FSH synthesis in vivo. Using a Cre/lox approach, I generated a conditional knockout (cKO) mouse where Foxl2 is selectively ablated in the anterior pituitary gonadotrope cells. I observed that cKO mice are hypogonadal and sub-fertile in adulthood. I showed that cKO mice exhibit impaired spermatogenesis and folliculogenesis. Indeed, cKO males have decreased sperm counts, whereas cKO females ovulate fewer oocytes during natural estrous cycles. I demonstrated that both male and female cKO mice are FSH-deficient, secondary to diminished pituitary Fshb mRNA production. In Foxl2-depleted primary pituitary cultures, both basal and activin A-stimulated Fshb expression is impaired. These results indicate that gonadotrope-specific FOXL2 is required for selective induction of FSH production in vivo. Besides its role in gonadotrope cells, FOXL2 is also expressed in the pituitary thyrotropes, the perioptic mesenchyme of the developing eyelid and the ovarian granulosa cells. However the mechanisms governing this selective expression have not been described. In order to study Foxl2 transcription, I cloned the murine promoter region of Foxl2. Next, I demonstrated a correlation between promoter CpG methylation status and gene expression, whereby methylation may repress Foxl2 expression in some heterologous cell lines. Our results indicate that Foxl2 is not regulated by its promoter sequence alone and unveil a possible role for CpG methylation in mediating Foxl2 cell-specific gene expression in the mouse. In summary, my thesis work defined a necessary role for pituitary FOXL2 in FSH synthesis and reproduction in vivo. The FSH deficiency observed in our gonadotrope-specific cKO mice is in agreement with the mechanisms describing a role for endogenous FOXL2 in murine Fshb transcription. Collectively, my research on pituitary FOXL2 is part of our unrelenting efforts to investigate the many factors implicated in FSH regulation, and ultimately required for normal reproductive function. This, in turn, may help identify causes of idiopathic infertility or novel drug targets for infertility and contraceptive treatments. === L'hormone folliculo-stimulante de l'hypophyse (FSH) est cruciale car elle régule gamétogenèse et fonction gonadique chez les mammifères. Une diminution dans la production de FSH peut mener à l'infertilité, mais les mécanismes contrôlant la synthèse de FSH demeurent incompris. Les activines de l'hypophyse stimulent la transcription du gène FSH sous-unité β (Fshb) dans les cellules gonadotropes; ceci est l'étape limitante dans la synthèse de l'hormone FSH. Les résults provenant de lignée gonadotrope immortalisée indiquent que la transcription de Fshb est stimulée par l'activine A; ceci est dépend des protéines homologues de Drosophila mothers against decapentaplegic (SMAD). Récemment, Forkhead box L2 (FOXL2) a été décrite comme étant un facteur-clé dans la stimulation de la transcription de Fshb induite par les SMADs et l'activine A. Ici, je dissèque les mécanismes expliquant la régulation et fonction de Foxl2 dans les cellules gonadotropes. Tout d'abord, la surexpression de FOXL2 et SMAD 2, 3, et 4 confère une réactivité à l'activine au promoteur du gène murin Fshb dans les cellules hétérologues. Sous stimulation par l'activine A, FOXL2 coopère de façon synergétique avec les SMADs pour activer le promoteur Fshb; cela nécessite que FOXL2 et SMAD3 (ou SMAD4) lient l'ADN. L'l'induction via SMAD3 du gène Fshb dépend de FOXL2 endogène dans les cellules homologues. Un élément proximal forkhead binding element (FBE) et un élément adjacent SMAD binding element (SBE) sont essentiels pour l'induction de l'activité du promoteur-reporter Fshb par FOXL2/SMAD3. Basé sur ces résultats, je propose un modèle où les activines stimulent la formation de complexes FOXL2-SMAD2/3/4 induisant la transcription du gène murinFshb via liaison à un élément SBE/FBE conservé du promoteur proximal. J'ai ensuite testé l'hypothèse que FOXL2 est nécessaire pour la synthèse de FSH in vivo en utilisant une approche Cre/lox: j'ai généré une souris knock-out conditionnelle (cKO) où Foxl2 est sélectivement absent dans les cellules gonadotropes. J'ai observé que les souris cKO sont hypogonadiques et souffrent d'une baisse de fertilité à l'âge adulte. J'ai démontré que la spermatogenèse et la folliculogénèse sont altérées chez les souris cKO. En effet, les cKO mâles ont un nombre diminué de spermatozoïdes, tandis que femelles cKO ovulent moins d'ovocytes pendant leur cycle oestral. J'ai démontré que cKO mâles et femelles sont déficientes en FSH, découlant d'une diminution d'ARN Fshb dans l'hypophyse. Les cultures primaires de cellules hypophysaires où Foxl2 est absent ne réagissent pas à l'activine A : Fshb est diminuée, tant au niveau basal que dans sa réponse au ligand. Ces résultats indiquent que l'expression de Foxl2 dans les gonadotropes est requise pour l'induction sélective de la production de FSH in vivo. Outre son rôle dans les gonadotropes, FOXL2 est également détecté dans les cellules thyrotropes de l'hypophyse, dans la paupière en développement et les cellules granuleuses de l'ovaire. Cependant les mécanismes qui régissent cette expression sélective n'ont pas encore été décrits. Afin d'étudier ce qui contrôle la transcription de Foxl2, j'ai cloné la région du promoteur murin de Foxl2. Ensuite, j'ai démontré une corrélation entre l'état de méthylation des CpGs du promoteur et l'expression des gènes, par lequel la méthylation exerce une inhibition sur le gène Foxl2 dans certaines cellules hétérologues. Mes résultats indiquent que Foxl2 n'est pas seulement contrôlé par la séquence de son promoteur et dévoilent un rôle possible pour la méthylation des CpGs dans la régulation de l'expression spécifique de Foxl2 chez la souris. En résumé, ma thèse définit un rôle nécessaire pour FOXL2 exprimé dans les gonadotropes pour la synthèse de Fshb et FSH, ainsi que la reproduction in vivo. Collectivement, mes recherches sur FOXL2 hypophysaire contribueront à identifier des causes de l'infertilité idiopathique ou encore trouver de nouvelles cibles pharmacologiques.