The therapeutic potential in eukaryotic mRNA translation

• Main Author: Malina, Abba
• Other Authors: Gerard Pelletier (Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2013
• Subjects: Biology - Molecular
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=114176

Inhibitors of translation have proven invaluable in delineating the overall mechanism of protein synthesis. Unlike inhibitors of prokaryotic protein synthesis, the therapeutic development of drugs that directly interfere in the eukaryotic mRNA translation for treatment of human disease has remained largely unexplored. To begin to investigate this possibility and expand the current repertoire of compounds that affect eukaryotic translation, we have undertaken several different experimental screening approaches, two of which are described below and will form the basis of this thesis. In chapter 2, we performed a multiplexed high-throughput chemical screen to identify novel inhibitors of eukaryotic protein synthesis. We identified intercalators as having unique biological properties in our assays: at high concentrations they behave like elongation inhibitors and blocked the peptidyl-transferase activity of the ribosome, while at lower concentrations they preferentially block HCV-driven, cap-independent but not cap-dependent translation. This activity appeared to be due to their ability to block the innate affinity of the HCV IRES for the 40S ribosomal subunit. Moreover, a number of intercalator-based peptide-conjugates (which can chemically "thread" through and bind strands of nucleic acid in a sequence-specific manner) were tested and one, PAC-6, was found to be a selective inhibitor of HCV-dependent initiation.In chapter 3, we performed a shRNA-based drop-out screen to identify novel genes and pathways that could reverse resistance to ABT-737 treatment. Using genetically-defined Arf-/-Eµ-myc lymphoma cells, pools of shRNAs targeting known factors and regulators of protein synthesis were retrovirally introduced and genomic DNA collected over the course 10 days for both vehicle and ABT-737 treated cohorts. Following deep sequencing analysis of shRNA abundance, several constructs were identified that were selectively depleted only in the presence of ABT-737. Of them, two shRNAs against the RNA/DNA helicase, DHX9, validated. Although knockdown of DHX9 was found to sensitize both mouse and human cells to ABT-737 treatment, it did so without altering Mcl-1 levels. Instead, loss of DHX9 appeared to activate a p53-dependent apoptotic program which was found to be both necessary and sufficient for the ABT-737-shDHX9 synthetic lethal interaction. === La compréhension du mécanisme global de la synthèse protéique a rapidement progressée en majeur partie grâce a l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques qui bloquent ce processus. Contrairement aux inhibiteurs de la synthèse protéique procaryote, l'utilisation de molécules pouvant moduler la traduction des ARNm eucaryotes dans un but thérapeutique reste encore largement sous-évalué. Afin d'étudier cette possibilité et d'élargir le répertoire de composés chimiques pouvant interférer avec la synthèse protéique eucaryote, nous avons effectué plusieurs criblage différents. Deux d'entre eux sont décrits plus bas et formeront les fondements de cette thèse.Tel que décrit dans le chapitre 2, nous avons tout d'abord effectué un criblage à haut débit de molécules afin d'identifier de nouveaux inhibiteurs de la synthèse protéique eucaryote. Ceci nous a permis de découvrir que les molécules qui peuvent s'intercaler dans les structures en double brin des acides nucléiques possèdent des propriétés uniques d'inhibition de la traduction. En effet, à hautes concentrations, elles se comportent exactement comme des inhibiteurs de l'élongation et bloquent l'activité peptidyl-transférase des ribosomes, alors qu'à faibles concentrations, elles bloquent préférentiellement la traduction cap-indépendant sous contrôle de l'IRES de HCV sans affecter la traduction dépendante du cap. Cette activité semble être due à la capacité des molécules d'interférer avec la liaison de la sous-unité 40S à l'IRES de HCV. De plus, certaines molécules qui combinent une portion intercalatrice et une portion peptidique (connue pour pouvoir sonder et se lier spécifiquement des brins d'acides nucléiques de manière spécifique) ont été testées et une d'entre elles, nommé PAC-6, permet l'inhibition spécifique de l'initiation de la traduction sous contrôle de l'IRES de HCV.Dans le chapitre 3, nous avons effectué un criblage d'une librairie de shRNA afin d'identifier des gènes ou des voies de signalisation qui peuvent inverser la résistance de cellules à ABT-737. Des cellules de lymphomes Arf-/-Eµ-Myc génétiquement modifiées ont été infecté avec un groupe de shRNAs ciblant des gènes connus pour contrôler tous les aspects de la synthèse protéique et avons isolé l'ADN génomique de ces cellules après 10 jours de traitements avec, soit le véhicule, soit avec ABT-737. Suite à l'analyse de l'abondance relative des shRNAs par séquençage de nouvelle génération, nous en avons identifié plusieurs dont la représentation diminue sélectivement en présence d'ABT-737. Parmi ceux-ci, deux shRNAs uniques, ciblant l'hélicase à ARN/ADN DHX9 ont été identifiés et par la suite confirmés indépendamment. La diminution des niveaux de DHX9 permet la sensibilisation des cellules murines ou humaines à ABT-737 sans toutefois altérer les niveaux de Mcl-1. Plutôt, la perte de DHX9 semble activer un programme d'apoptose dépendant de p53 qui est nécessaire et suffisant pour cette interaction synthétique létale entre ABT-737 et DHX9.