| Summary: | ABSTRACTCD4+Foxp3+ regulatory T cells (TREG) are pivotal in the maintenance of immune tolerance to self-antigens and act as regulators of autoimmune reactions. There are two subsets of TREG: naturally occurring (nTREG) which develop in the thymus and inducible (iTREG) which are generated from conventional Foxp3- effector T cells (TCONV) in the periphery or in vitro. While both subsets require Foxp3 expression to function, iTREG cells gradually downregulate Foxp3 in vitro and lose their suppressive capabilities. In contrast, nTREG cells show constitutive Foxp3 expression and demonstrate stable suppressive function in vitro. Recent studies reveal a region of the Foxp3 locus that is differentially methylated between nTREG and iTREG. The methylation-sensitive region, known as the TREG-specific demethylated region (TSDR), is completely unmethylated in nTREG, partially methylated in iTREG, and heavily methylated in TCONV, suggesting that differential methylation patterns of the TSDR may account for unstable Foxp3 expression in iTREG. Methylation is mediated by DNA methyltransferase (DNMTs) enzymes, and several inhibitors are known to block their activity. In this study, we use 5'-Aza-2'-deoxycytidine (Aza), a nucleoside analog inhibitor, and RG108, a non-nucleoside inhibitor to determine whether inhibition of DNMTs and thus methylation, impacts Foxp3 expression and iTREG development in culture. Our results show that DNMT inhibition in the absence of TGF-β was unable to induce Foxp3 expression in TCONV cells. However, in TCONV cells that were pre-exposed to TGF-β, Aza and RG108 induced Foxp3 expression in a significant number of cells. Moreover, a higher proportion of Foxp3-expressing cells with stronger Foxp3 MFI were induced when Aza was used in conjunction with TGF-β suggesting an additive and non-redundant effect of DNMT-inhibition. Although iTREG cells typically downregulate Foxp3 in the absence of TGF-β, treatment with Aza alone prolongs the persistence of Foxp3 expression. Neither Aza nor RG108 was as effective as TGF-β in maintaining Foxp3 expression. Collectively, our data shows that DNMT inhibition without TGF-β is insufficient to induce Foxp3 expression but in conjunction, can increase induction and strengthen Foxp3 expression. DNMT inhibition can also prolong Foxp3 expression in the absence of TGF-β possibly by disrupting epigenetic silencing mechanisms. === ABRÉGÉLes lymphocytes T régulateurs CD4+Foxp3+ (TREG) sont des pivots dans le maintien de la tolérance immunitaire aux antigènes autologues et agissent en tant que régulateurs des réactions auto-immunes. Il y a deux sous-ensembles de TREG : les naturelles (nTREG) qui se développent dans le thymus et les inductibles (iTREG) qui sont générés à partir des lymphocytes T effecteurs Foxp3- conventionnels (TCONV) en périphérie ou in vitro. Bien que les deux sous-ensembles requièrent l'expression de Foxp3 pour fonctionner, les lymphocytes iTREG régulent graduellement de manière négative Foxp3 in vitro et perdent leur capacité suppressive. En revanche, les lymphocytes nTREG présentent une expression constitutive de Foxp3 et démontrent une fonction suppressive stable in vitro. Des études récentes révèlent une région du locus Foxp3 qui est différentiellement méthylée entre les nTREG et les iTREG. La région sensible à la méthylation, connue sous le nom de la région déméthylée spécifique à TREG (TREG-specific demethylated region, TSDR), est complètement non méthylée dans les nTREG, partiellement méthylée dans les iTREG, et fortement méthylée dans les TCONV. Cela suggère que les modèles de méthylation différentielle du TSDR pourraient expliquer l'expression instable de Foxp3 dans les iTREG. Les enzymes ADN méthyltransférases (DNA methyltransferases, DNMTs) servent de médiatrices dans la méthylation, et quelques inhibiteurs sont connus pour bloquer leur activité. Dans cette étude, nous utilisons le 5'-Aza-2'-déoxycytidine (Aza), un inhibiteur analogue nucléosidique, et RG108, un inhibiteur non-nucléosidique, pour déterminer si l'inhibition des DNMTs et ainsi la méthylation, aurait un impact sur l'expression de Foxp3 et le développement de iTREG en culture. Nos résultats montrent que l'inhibition de DNMT en l'absence de TGF-β n'a pas pu induire l'expression de Foxp3 dans les lymphocytes TCONV. Toutefois, dans les lymphocytes TCONV qui étaient pré-exposés au TGF-β, Aza et RG108 ont induit l'expression de Foxp3 dans un nombre important de lymphocytes. De plus, une proportion plus grande de lymphocytes exprimant le Foxp3 avec un Foxp3 MFI plus élevé étaient induits lorsque Aza était utilisé conjointement avec TGF-β, suggérant un effet additif et non redondant de l'inhibition de DNMT. Malgré que les lymphocytes iTREG régulent généralement de façon négative Foxp3 en l'absence de TGF-β, le traitement par Aza seul prolonge la persistance de l'expression de Foxp3. Ni Aza, ni RG108 n'est aussi efficace que TGF-β dans le maintien de l'expression de Foxp3. En somme, nos données montrent que l'inhibition de DNMT sans TGF-β est insuffisant pour induire l'expression de Foxp3, mais que conjointement, peut en augmenter l'induction et la renforcer. L'inhibition de DNMT peut également prolonger l'expression de Foxp3 en l'absence de TGF-β possiblement en perturbant les mécanismes d'inhibition épigénétique.
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