| Summary: | Chromosome segregation is the crucial step for cell division in most living organisms. In order to segregate the chromosomes equally into mother and daughter cells, the cell needs to build a spindle, which comprises three major components: chromosomes, microtubules and microtubule organizing center (centrosome in animal cells or spindle pole body in fungal cells). The building and normal execution of spindle function are tightly linked to cell cycle control system. gamma-Tubulin is an evolutionally conserved protein with its canonical function as a microtubule nucleator. Here we report that gamma-tubulin is phosphorylated at residue S360, a Cdk1/Cdc28 site. Phosphorylation of S360 in vivo was identified in a global analysis of the phosphoproteome of the spindle pole body (J. Keck and M. Jones, et al.). We confirmed Cdc28-Clb2 can phosphorylate S360 by in vitro kinase assay and peptide identification by mass spectrometry, and in vivo assay using two dimensional-polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE). A phospho-mimetic mutation (tub4-S360D) causes mitotic delay but does not inhibit recruitment of the gamma-tubulin complex (reported by GRIP Spc97-EGFP) to spindle poles. Analysis of synthetic genetic interactions and live cell imaging revealed that cytoplasmic microtubule function is normal in tub4-S360D cells but spindle microtubule function is perturbed. High-resolution analysis of spindle dynamics revealed fluctuations in length in metaphase and anaphase spindles. The velocities of spindle elongation in anaphase are similar in S360D and WT spindles, but the initial phase of rapid elongation in anaphase is prolonged in the S360D mutant, and spindle breakdown is delayed. Interpolar microtubules play a central role in spindle assembly and are actively responsible for spindle elongation with sliding forces generated from microtubule cross-linking proteins such as kinesin-5 (Cin8 in budding yeast). Genetic analysis indicates that mutations in proteins that act redundantly to Cin8 enhance the growth defect in S360D, and S360A can partially suppress deletion of Cin8. High-resolution tomography analysis of S360D mutant and WT cells reveals that the interpolar microtubules organization in S360D is completely perturbed, as almost none overlapping of interpolar microtubules were observed.Therefore, we conclude that S360 phosphorylation of gamma-tubulin/Tub4 by Cdk1/Cdc28 plays an important role in the control of spindle microtubule organization during spindle assembly, through docking and/or monitoring critical microtubule associated proteins, for example Cin8, at microtubule minus end hence regulating their functions on the plus end. === La ségrégation des chromosomes est une étape cruciale pour la division des cellules de la plupart des être vivants. Pour que les chromosomes ségrégent également entre les cellules mère et fille, la cellule doit produire un fuseau comprenant trois composants : les chromosomes, les microtubules et un centre d'organisation des microtubules (le centrosomes chez les cellules animales ou le spindle pole body chez les cellules fongiques). La production et l'exécution normale de la fonction du fuseau sont étroitement couplées au système de contrôle du cycle cellulaire.La gamma-tubuline, une protéine très conservée dans l'évolution, a une fonction de nucléation des microtubules. Nous reportons ici que la gamma-tubuline est phosphorylée au résidu S360, un site pour Cdk1/Cdc28. Initialement identifiée in vivo lors d'une analyse globale du phosphoprotéome du spindle pole body (J. Keck and M. Jones, et al.), la phosphorylation de S360 par Cdc28-Clb2 est confirmée par nos travaux in vitro grâce à des essais kinase suivis d'identification de peptides par spectroscopie de masse et in vivo grâce à l'électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide (2D-PAGE). Une mutation phospho-mimétique (tub4-S360D) provoque un délai mitotique mais n'inhibe pas le recrutement du complexe de gamma-tubuline (détecté grâce à GRIP Spc97-EGFP) aux pôles du fuseau. Les études des interactions génétiques synthétiques et d'imagerie sur cellules vivantes révèlent que la fonction cytoplasmique des microtubules est normale chez le mutant tub4-S360D alors que la fonction des microtubules au niveau du fuseau est perturbée. Une analyse dynamique à haute résolution révèle des fluctuations de la longueur des fuseaux en métaphase et en anaphase. Bien que les vitesses d'élongation du fuseau durant l'anaphase soient similaires chez le mutant S360D et chez le sauvage, la phase initiale d'élongation rapide en anaphase est prolongée et la déconstruction du fuseau est retardée chez la mutant S360D.Les microtubules interpolaires jouent un rôle central dans l'assemblage du fuseau est sont activement responsables de l'élongation du fuseau grâce aux forces de glissement générées par les protéines liant les microtubules telle la kinesine-5 (Cin8 dans la levure de boulangerie). Une analyse génétique indique que des mutations de protéines redondantes avec Cin8 augmentent le défaut de croissance du mutant S360D alors que la mutation S360A supprime partiellement la délétion de Cin8. L'analyse tomographique à haute résolution de cellules du mutant S360D et de cellules sauvages révèle une perturbation extrême de l'organisation des microtubules interpolaires du mutant S360D avec très peu de microtubules interpolaires chevauchants observés.En conséquence, nous concluons que la phosphorylation du résidu S360 de la gamma-tubuline/Tub4 par Cdk1/Cdc28 joue un rôle important dans le contrôle de l'organisation des microtubules au cours de l'assemblage du fuseau, via l'arrimage et/ou le contrôle de protéines associées aux microtubules à l'extrémité (-) des microtubules, comme Cin8, et la régulation de leur fonction à l'extrémité (+) des microtubules.
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