Genetic analysis of the TCA cycle enzyme 2-oxoglutarate dehydrogenase in Sinorhizobium meliloti

• Main Author: Al Maleh, Rawan
• Other Authors: Brian T Driscoll (Internal/Supervisor)
• Format: Others
• Language: en
• Published: McGill University 2012
• Subjects: Biology - Microbiology
• Online Access: http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=106341

Genetic characterization of the mdh-sucCDAB operon, encoding enzymes of the TCA cycle, was performed. Isolation of a sucA knock-out mutant was attempted through homologous recombination with plasmids carrying a mutated fragment of the sucA gene. Several strains were screened for the expected phenotype of a 2-OGD mutant. Carbon-source utilization phenotype of the tested strains did not reveal highly dissimilar growth patterns in comparison to wild-type levels. PCR amplification of these strains did not yield the expected band size of a mutant copy of the gene. Furthermore, Southern blot analysis of the putative mutants was inconclusive in confirming their identity. Therefore, a sucA mutant was not successfully isolated. Expression of TCA cycle genes was examined under different growth conditions through qRT-PCR analysis. The sucA gene did not reveal any increase in transcript levels relative to sucD, under all tested conditions. This indicated the possible absence of a promoter independently controlling its expression. Other TCA cycle genes were differentially expressed in mdh and sucB mutants in comparison to wild type. Expression patterns did not appear to vary greatly across the tested carbon sources. Comparison of expression of TCA cycle genes in mutants, relative to wild type, revealed significant induction of sucB with arabinose in its respective knock-out mutant. Examination of transcript levels in bacteroids would elucidate the gene expression patterns observed in symbiotic conditions. In addition, further investigation of the nature of a sucA mutation will be required, to determine the possibility of a lethal phenotype. === La caractérisation génétique de l'opéron mdh-sucCDAB qui encode des enzymes du cycle des acides tricarboxylique, a été effectuée. Isolement d'un mutant de sucA a été tentée par recombinaison homologue avec des plasmides portant une insertion dans le gène. Plusieurs souches ont été criblées pour le phénotype attendu d'un mutant de la déshydrogénase de 2-oxoglutarate. Le phénotype d'utilisation de carbone des souches testées n'ont pas révélé de modèles de croissance très dissemblables par rapport au phénotype sauvage. L'amplification par PCR de ces souches n'a pas donné la taille de la bande attendue d'une copie mutant du gène. L'analyse par Southern blot des mutants putatifs n'a pas été concluante pour confirmer leur identité. Par conséquent, l'isolement d'un mutant de sucA a échoué. L'expression des gènes du cycle des acides tricarboxylique a été examinée avec des conditions différentes grâce à qRT-PCR. L'inspection d'expression génétique de sucA n'a pas révélé une augmentation par rapport à la transcription de sucD. Cela indique une possibilité de l'absence d'un promoteur indépendant contrôlant son expression. D'autres gènes du cycle des acides tricarboxyliques sont exprimés différentiellement par les mutants de mdh et de sucB, en comparaison au type sauvage. Les profils d'expression ne semblent pas varier considérablement selon les sources de carbone testées. Comparaison de l'expression de ses gènes a révélé induction significative de sucB avec l'arabinose dans se mutant respectif. L'observation de transcription dans les bactéroïdes serait élucider l'expression dans des conditions symbiotique. Une enquête plus approfondie d'une mutation de sucA sera nécessaire, afin de déterminer la possibilité d'un phénotype résultant mortelle.