A directed evolution design of target specificity and kinetic analysis of conformational transitions in the HhaI methyltransferase

• Main Author: Gerasimaitė, Rūta
• Other Authors: Mildažienė, Vida
• Format: Doctoral Thesis
• Language: English
• Published: Lithuanian Academic Libraries Network (LABT) 2011
• Subjects: Biochemistry; DNA methyltransferase; Specificity; Base flipping; DNR metiltransferazės; Specifiškumas; Bazės išsukimas
• Online Access: http://vddb.laba.lt/fedora/get/LT-eLABa-0001:E.02~2011~D_20110519_082240-87105/DS.005.1.01.ETD

DNA cytosine-5 methyltransferases (MTases) recognize short DNA sequences and catalyze the transfer of the methyl group from the cofactor AdoMet to the C5-position of a target cytosine. In this work both these aspects of the MTase mechanism have been addressed. First, using rational protein design and directed evolution approaches the specificity of the HhaI MTase, GCGC, has been changed to GCG by functional elimination of one of the two target recognition elements. In addition, the introduced structural changes endowed the MTase with the ability to transfer extended groups from synthetic cofactor analogs, providing the first example of a dual specificity change in a DNA MTase. Second, the kinetics of fast pre-catalytic conformational transitions in the MTase and DNA has been investigated. A new method to follow the target cytosine flipping and its subsequent covalent activation has been proposed, which allows a direct real-time observation of these processes by monitoring associated UV absorbance changes in a chemically unperturbed DNA. These studies for the first time demonstrate that the flipping of the target cytosine and the closure of the catalytic loop in the enzyme occur simultaneously, whereas the covalent activation of the target cytosine and the transfer of the methyl group are temporally distinct steps in the catalytic cycle of M.HhaI. Since the new method is based on the general phenomenon of hyperchromicity, it is thus applicable for studies of other systems... [to full text] === DNR citozino-5 metiltransferazės (MTazės) atpažįsta specifines DNR sekas ir katalizuoja metilgrupės pernešimą nuo kofaktoriaus AdoMet ant taikinyje esančio citozino. Šiame darbe nagrinėjami abu MTazių veikimo mechanizmo aspektai. Baltymų inžinerijos ir kryptingos evoliucijos metodais pašalinant vienos iš dviejų taikinio atpažinimo kilpų funkciją, MTazės HhaI atpažįstamas taikinys GCGC pakeistas į GCG. Dėl įvestų struktūros pakeitimų nauja unikalaus specifiškumo MTazė efektyviai katalizuoja ne tik metilo, bet ir didesnių grupių pernešimą nuo sintetinių kofaktoriaus analogų, ir gali tapti naudingu molekulinės biologijos įrankiu. Katalitinės reakcijos metu MTazės kilpa užsidaro, apglėbdama surištą DNR, o taikinio citozinas išsukamas iš DNR spiralės ir aktyvuojamas, kovalentiškai prisijungiant katalitiniam cisteinui. Šiems greitiems prieškatalitiniams procesams tirti buvo panaudotas naujas metodas, leidžiantis realiu laiku stebėti M.HhaI sąlygotą citozino išsukimą bei kovalentinę aktyvaciją, registruojant mažus UV absorbcijos pokyčius gamtinį substratą atitinkančioje DNR. Pirmą kartą parodyta, kad M.HhaI katalizuojamoje reakcijoje citozino išsukimas ir katalitinės kilpos užsidarymas vyksta sinchroniškai, o kovalentinė citozino aktyvacija ir metilgrupės pernešimas yra kinetiškai netapačios katalitinio ciklo stadijos. Kadangi naujasis metodas remiasi fundamentine nukleorūgščių savybe – hiperchrominiu efektu, todėl jis gali būti naudojamas ir kitų DNR bazę išsukančių baltymų... [toliau žr. visą tekstą]