Avaliação de uma análise automatizada para determinação de atividade enzimática

• Main Author: Estrela, Mariely Cordeiro
• Other Authors: Pichorim, Sérgio Francisco
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Tecnológica Federal do Paraná 2017
• Subjects: CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA BIOMEDICA::BIOENGENHARIA::PROCESSAMENTO DE SINAIS BIOLOGICOS; Enzimas; DNA; Reação em cadeia de polimerase; Controle de processo; Processamento de imagens - Técnicas digitais; Métodos de simulação; Engenharia biomédica; Enzymes; Polymerase chain reaction; Process control; Image processing - Digital techniques; Simulation methods; Biomedical engineering; Engenharia Biomédica
• Online Access: http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/2875

O Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP) atua na produção de insumos para detecção de doenças. Em parceria com Bio-Manguinhos (Fiocruz) é atualmente responsável pelo fornecimento do módulo de amplificação do KIT NAT Brasileiro para o diagnóstico molecular de HIV (AIDS), HCV (Hepatite C) e HBV (Hepatite B), entre outros produtos para diagnóstico in vitro. O teste molecular consiste basicamente, na amplificação do material genético do vírus (DNA ou RNA) através da técnica de PCR (reação em cadeia pela polimerase) em tempo real, que possibilita a detecção do agente patógeno a partir de pequenas quantidades de ácido nucleico presente na amostra. A reação de PCR ocorre pela atividade da Taq DNA Polimerase, uma enzima termostável amplamente utilizada para replicação seletiva de fragmentos de DNA. Esta enzima foi isolada a partir de uma bactéria termofílica, denominada Thermus aquaticus e é produzida pelo IBMP, sendo considerada um insumo de alta criticidade. Uma das etapas de controle do processo produtivo dessa enzima é a avaliação do extrato bruto enzimático e a determinação da atividade da enzima purificada. O método de quantificação consiste em avaliar a atividade enzimática através da metodologia de PCR convencional, seguida por uma análise do perfil eletroforético das amostras em gel de agarose. No entanto, a metodologia empregada atualmente apresenta uma grande subjetividade, visto que a interpretação dos resultados pode sofrer variações quando analisados por diferentes operadores. O objetivo do presente trabalho é avaliar a implementação de uma análise automatizada dos resultados através do processamento digital de imagens, que além de facilitar sobremaneira as rotinas laboratoriais, pode ser a chave para resultados com maior grau de precisão e repetibilidade, eliminando assim o viés subjetivo do analista. A nova metodologia de análise implica em menor interferência do analista na interpretação dos resultados. O método proposto foi testado em um conjunto de imagens e os resultados obtidos foram comparados com os valores da análise manual atualmente utilizada. Os resultados foram considerados promissores, pois a análise automatizada, além de reduzir significativamente o tempo de análise, possibilita uma padronização dos resultados. === The Molecular Biology Institute of Paraná (IBMP) acts in the production of inputs for detection of diseases. In partnership with Bio-Manguinhos (Fiocruz), it is currently responsible for manufacturing the amplification module of the Brazilian NAT KIT for HIV (AIDS), HCV (Hepatitis C) and HBV (Hepatitis B), besides other products for molecular diagnostics. The molecular test basically consists of amplifying the genetic material of the virus (DNA or RNA) through the real-time PCR (polymerase chain reaction) technique, which enables detection of the pathogen from small amounts of nucleic acid present in the sample. The PCR reaction occurs by the activity of Taq DNA Polymerase, a thermostable enzyme widely used for selective replication of DNA fragments. This enzyme was isolated from a thermophilic bacterium, called Thermus aquaticus and is produced by the IBMP, being considered an input of high criticality. One of the steps in controlling the production process of this enzyme is the evaluation of the enzymatic extract and the determination of the activity of the purified enzyme. The quantification method consists in evaluating the enzymatic activity through the conventional PCR methodology, followed by an analysis of the electrophoretic profile of the agarose gel samples. However, the methodology currently used presents a great subjectivity, since the interpretation of results can suffer variations when analyzed by different operators. The objective of the present work is to evaluate the implementation of an automated analysis of the results through digital image processing, which in addition to facilitating the laboratory routines, can be the key to results with a greater degree of precision and repeatability, thus eliminating the subjective bias of the analyst. The new methodology of analysis implies less interference of the analyst in the interpretation of the results. The proposed method was tested in a set of images and the obtained results were compared with the values of the manual analysis currently used. The results were considered promising because the automated analysis, besides significantly reducing the analysis time, allows a standardization of the results.