Desenvolvimento de peptídeos recombinantes epítopos específicos do Rhipicephalus (Boophilus) microplus selecionados por bibliotecas de Phage Display

• Main Author: Prudencio, Carlos Roberto
• Other Authors: Goulart Filho, Luiz Ricardo
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Uberlândia 2016
• Subjects: Epítopos; Vacinas; Riphicephalus (Boophilus) microplus; Vacinas sintéticas; Biotecnologia animal; Peptídeos - Vacinas; Epitopes; Phage Display; Vaccines; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
• Online Access: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15704

Ticks are implicated in serious economic losses to animal production worldwide in the order of billions of dollars. Although many antigens have been in vaccine tests, none has been effective in the control of ticks, which justifies the development of new antigens as well as new vaccine strategies. Phage Display techniques have been widely employed to map epitope structures, which have served as the basis for developing molecular vaccines. In the present study, we have applied this technique to map specific epitopes of Rhipichephalus (Boophilus) microplus and to validate the peptides as potential immunogens, we have adopted a process of selection prior to final field tests. This strategy was established in order to reduce the number of clones to be tested in the field. Six Phage -displayed random peptide libraries were selected with seven different strategies against the purified hyperimmune serum of chickens (IgY) that were immunized with total proteins of larvae and adults of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. The selected Phage clones were sequenced, translated and analyzed through bioinformatics. To evaluate the potential of these phagotopes as effective candidate vaccines, ELISA assays, dot-blot, mice immunization (MI), humoral immune response (HIR) of cattle against the clones and a cutaneous hypersensitivity tests in cattle were performed. The selected Phage clones were analyzed through bioinformatics, generating 107 different peptides in a total of 281 sequences. Some selected phagotopes showed excellent matches with linear sequences of known proteins of the Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Peptides that did not present significant matches with known proteins, but shared extensive homology among each other, were clustered and classified as conformational epitopes of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, or considered as mimotopes of unknown proteic antigens. Among all clones tested by dot-blots, the 40 most reactive ones were further screened by HIR and MI. The mice sera raised against the Phage clones clearly recognized tick proteins indicating that the phagotope-induced immune responses were antigen-specific, but not all could be identified by the sera of naturally infested cattle (Bos taurus and Bos indicus). Four clones were then selected to go through the cutaneous hypersensitivity tests, and apparently all of them were effectives at diferent degrees. The stringent selection processes coupled with this schemes of validation assays allowed us to narrow down the number of peptides that should be tested in the field. One of the advantages of using whole recombinant M13 virus, carrying the recombinant peptide in fusion with the pIII protein of the virus, is that its capsid acts as adjuvant and could be tested directly without any further mixture. Additionally, we have finally used anergy skin tests (cutaneous hypersensitivity tests) once they are sometimes used to guide clinical decisions. We have assumed that cutaneous hypersensitivity tests measure a common property of cellular immune function relevant to the outcome, which together with the humoral response in naturally infested animals may provide us with sequences of peptides that may be relevant as vaccines. Finally, we have used those sequences to produce multiple antigen peptide system (MAPS), which will be used in future field tests. The present work demonstrates that the whole epitope profile can obtained through screening the Phage Displayed peptide libraries with the hyperimmune serum and reveals the potential of using epitopedisplaying Phage s as peptide vaccines against ticks. === Os carrapatos tem provocado significativas perdas econômicas na produção animal mundial na ordem de bilhões de dólares anuais. Embora vários antígenos específicos tenham sido empregados em testes vacinais, nenhum tem propiciado controle eficaz, sendo necessária a identificação de novos antígenos, bem como de novas estratégias vacinais. A tecnologia de Phage Display tem sido amplamente empregada no mapeamento de estruturas antigênicas as quais tem servido como base para o desenvolvimento de vacinas moleculares e representa uma alternativa as metodologias tradicionais. No presente trabalho, utilizou-se a tecnologia para o mapeamento de epítopos do Rhipicephalus (Boophilus) microplus e, para validar os peptídeos selecionados como potencial imunógenos, foi adotado um processo com múltiplas etapas de caracterização dos clones previamente aos ensaios clínicos. Esta estratégia foi estabelecida com o objetivo de reduzir o número de clones a ser testados em bovinos como imunógenos candidatos. Foram utilizadas para a seleção seis bibliotecas distintas de peptídeos randômicos expressados em bacteriófagos filamentosos e sete estratégias de seleção contra as imunoglobulinas (IgY) purificadas de soro hiperimune de galinhas imunizadas com proteínas totais de larvas e adultos de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. As seqüências do DNA correspondente aos insertos dos fagos selecionados foram seqüenciados, traduzidos e analisados por análises in silico. Foram realizados testes de ELISA, Dot-Blot, imunização em camundongos, determinação da resposta imune humoral de bovinos naturalmente infestados, e a medição da hipersensibilidade cutânea com o objetivo de evoluir o potencial destes fagotopos como candidatos efetivos a novos imunógenos. Foram gerados 107 peptídeos distintos em um total de 281 seqüências, sendo alguns destes similares às seqüências protéicas lineares do Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Os peptídeos sem similaridades significativas com proteínas conhecidas, mas que apresentaram seqüências consenso entre os peptídeos obtidos, foram agrupados e classificados como epítopos conformacionais ou considerados como mimetopos de antígenos protéicos desconhecidos do Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Entre os clones testados por Dot-Blot, os 40 mais reativos foram posteriormente testados em ensaios de imunização em camundongos e também submetidos ao reconhecimento humoral de bovinos naturalmente infestados com carrapatos. Adicionalmente, utilizou-se o teste cutâneo de hipersensibilidade para a análise da imunidade celular. Os soros de camundongos imunizados com os clones de fagos foram reativos as proteínas de carrapato indicando que os fagotopos foram capazes de gerar resposta imune antígeno específica, embora nem todos os fagos fossem reconhecidos pelo soro de animais naturalmente infestados (Bos taurus e Bos indicus). Após a caracterização e validação, quatro fagotopos foram escolhidos para a realização dos testes cutâneos, os quais apresentaram graus variados de reatividade. Uma das vantagens da utilização do vírus M13 recombinante, contendo o peptídeo recombinante fusionado na proteína PIII do vírus, é que o próprio capsídio atua como adjuvante e pode ser testado diretamente após a seleção sem procedimentos adicionais de preparo do antígeno. Finalmente, as seqüências determinadas foram utilizadas para a produção e expressão de um sistema recombinante de múltiplos antígenos peptídicos (MAPS). Foram escolhidos 10 peptideos para a expressão na forma de multi-epitopos, os quais serão futuramente utilizados em ensaios clínicos. O presente trabalho demonstrou que um perfil geral dos epítopos pode ser obtido através da utilização de bibliotecas de peptídeos randômicos expressados em bacteriófagos filamentosos contra anticorpos obtidos de soro hiperimune e revela o potencial da seleção e utilização peptídeos epítopos específicos como potenciais vacinas recombinantes multiantigênicas para o controle do carrapato bovino. === === Doutor em Genética e Bioquímica