Avaliação do uso de sais na precipitação de uma proteína empregada como agente antiviral

• Main Author: Carvalho, Kamilla Alves
• Other Authors: Resende, Miriam Maria de
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Uberlândia 2016
• Subjects: Proteínas - Análise; Precipitação (Química); Agentes antivirais; CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA QUIMICA
• Online Access: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15259

Recombinant proteins expressed in cell culture have been shown to be relevant in the biopharmaceutical production focusing human heaths. Insulin, interferon and vaccine against B hepatitis are products obtained from recombinant expression system. Importantly, the precipitation is a widely used technique for separating proteins from a mixture due to its simplicity, and the process is incremented by the use of salts. This study initially dealt with the validation of the salt precipitation method by using the purified BSA and trypsin, and then, to investigate the precipitation process of recAVLOEc protein synthesized by cells of E. coli BL21 (DE3) pLysS used as expression system for the AVLO. This protein has shown antiviral activity and it found in the hemolymph of Lonoimia obliqua caterpillar. The precipitation was conducted by the use of conventional salts (ammonium sulfate and sodium sulfate) and the volatile salt ammonium carbamate. The proteins of the bacterial expression system were evaluated for their antiviral potential virus-infected cell cultures. Bacterial cells were resuspended in phosphate buffer and lysade by ultrasound. In the experimental procedure, the saturated salt solution (ammonium sulfate, sodium sulfate or ammonium carbamate) was added dropwise to the protein solution. This mixture was kept at constant temperature of 5°C for 24 h. The supernatant phase was separated from the precipitate phase by centrifugation. The protein precipitate obtained from bacterial lysate was then added to cultures of L929 and Vero cells to evaluate the cytotoxic effect; and cultures of these cells were subsequently infected with virus (EMC and measles). The results showed better efficiency of sodium sulfate on the precipitation of BSA compared to ammonium sulfate, while for trypsin, the ammonium carbamate showed more effective. Toxic effect on the culture of L929 cells was observed for the precipitate obtained by the use of ammonium sulfate and sodium sulfate. However, as expected, the precipitated protein obtained by the use of volatile ammonium carbamate salt showed a lower cytotoxic effect. Tests in L929 cultures infected with EMC, were performed; however, protein samples obtained by conventional and volatile salts used as a precipitating agent did not show antiviral action. In Vero cell cultures, the precipitated protein from cell lysate by sodium sulfate showed antiviral action for measles. === Proteínas recombinantes, expressas em culturas celulares, têm se mostrado importantes na produção de fármacos de interesse para a saúde humana. Insulina, interferons e a vacina contra a hepatite B são exemplos de produtos obtidos a partir de sistemas recombinantes de expressão. A precipitação é uma técnica amplamente empregada para separação de proteínas a partir de uma mistura devido à sua simplicidade, sendo tal fato potencializado pelo uso de sais. Este estudo, inicialmente, abordou a validação do método de precipitação salina das proteínas puras BSA e tripsina e em adição a investigação do processo de precipitação da proteína recAVLOEc, sintetizada por células de E. coli BL21 (DE3) pLysS utilizadas como sistema de expressão. Tal proteína é originalmente encontrada na hemolinfa da lagarta Lonomia obliqua. A precipitação foi conduzida por meio do uso de sais convencionais (sulfato de amônio e de sódio) e do sal volátil carbamato de amônio. As células bacterianas foram ressuspendidas em tampão fosfato e submetidas à lise mecânica. No procedimento experimental estabelecido, o contato de um concentrado proteico com uma solução salina saturada (sulfato de amônio, sulfato de sódio ou carbamato de amônio) foi mantido por 24 horas a 5°C. O sobrenadante foi isolado do precipitado por meio de centrifugação e estas frações tiveram sua concentração proteica determinada através do método de Bradford. O precipitado proteico obtido do lisado bacteriano foi então administrado em culturas de células L929 e Vero para a avaliação do efeito citotóxico e posteriormente para a verificação da ação antiviral para o EMC e o sarampo. Os resultados demonstraram maior eficiência do sulfato de sódio na precipitação da BSA quando comparado ao sulfato de amônio. Enquanto que para a tripsina o carbamato de amônio foi mais efetivo. Um efeito tóxico em culturas de L929 foi observado para os precipitados obtidos pelo uso de sulfato de amônio e de sódio. Entretanto, como esperado, o precipitado proteico obtido pelo uso do sal volátil carbamato de amônio apresentou menor efeito citotóxico. Os testes em culturas de L929 infectadas com o vírus EMC foram efetuados e as amostras de proteínas precipitadas com os sais convencionais e o sal volátil não resultaram em ação antiviral. Em culturas de células Vero, o uso do sulfato de sódio como agente de precipitação das proteínas contidas no lisado bacteriano resultou em ação antiviral para o sarampo. === Mestre em Engenharia Química