| Summary: | CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior === Hyaluronic acid (HA) is a linear, unbranched polymer, composed by simple disaccharide units, whose molar mass may range in a wide interval of distribution (104-107 Da). It is used in pharmaceutical and cosmetic applications depending on its average molecular mass. The fractionation of macromolecules of the order of magnitude of the HA may be performed by gel permeation or size-exclusion chromatography (GPC). The objective of this work is to study the characterization, purification and fractionation of microbial HA by using GPC. HA was supplied by the Department of Biotechnological Processes (DPB/FEQ/UNICAMP), having been produced by microorganisms â Streptococcus zooepidemicus â in synthetic culture media. After being centrifuged from the fermentation broth, HA was precipitated with ethanol and then dissolved in saline solution, this pre-purification procedure being performed up to four times. The presence of proteic contaminants was identified by electrophoresis in polyacrylamide gel under denaturant conditions (SDS-PAGE) and quantified by the Bradford method. For the HA sample which had been precipitated in ethanol and dissolved in 0.1 M NaNO3 four times, protein concentration was found to be nearly 100 μg/mL. The sodium salt of commercial (Sigma Aldrich - EUA) microbial HA was used as standard in order to measure a calibration curve to assess HA concentration in the samples. For the sample precipitated in ethanol and dissolved in 0.1 M NaNO3 four times, AH concentration was found to be approximately 780 μg/mL. Molar mass distribution of HA samples was assessed by GPC, both in analytical and semi-preparative scale, using refractive index (RI) and UV/Vis (280 nm) detectors, 0.1 M NaNO3 as mobile phase, flow rate 0.8 mL/min and tracers dextran and pullulan (polymers of similar hydrodynamic volume as compared to HA) as molar mass standards. The samples showed molar mass distributions in the range of 103 to 107 Da, after being precipitated and dissolved four times. For these samples, the average molar mass was found to be in the order of magnitude of 105 Da. In the semi-preparative column Superose, it was possible to separate HA fractions, with molar mass above 105 Da, and free of proteic contaminants, in an elution interval of 10 minutes === O Ãcido HialurÃnico (AH) à um polÃmero linear, nÃo ramificado, composto por unidades dissacarÃdicas simples, cuja massa molar pode se distribuir num largo intervalo (104-107 Da). à usado em aplicaÃÃes farmacÃuticas e cosmÃticas dependendo de sua massa molar mÃdia. A separaÃÃo de macromolÃculas da ordem de grandeza do AH à possÃvel atravÃs da Cromatografia de permeaÃÃo em gel (GPC). Este trabalho tem como objetivo estudar a caracterizaÃÃo, purificaÃÃo e fracionamento do AH produzido por microorganismos, utilizando GPC. O AH, cedido pelo Departamento de Processos BiotecnolÃgicos (DPB/FEQ/UNICAMP), foi obtido por cultivo de microorganismos - Streptococcus zooepidemicus - em meio de cultura sintÃtico. ApÃs centrifugaÃÃo do caldo de fermentaÃÃo, o AH foi precipitado com etanol e ressuspenso em soluÃÃo salina, sendo esta etapa de prÃ-purificaÃÃo executada atà quatro vezes. A presenÃa de contaminantes protÃicos foi identificada por eletroforese em gel de poliacrilamida sob condiÃÃes desnaturantes (SDS-PAGE) e quantificada pelo mÃtodo de Bradford, obtendo-se 97,20 μg/mL, para a amostra de AH apÃs quatro precipitaÃÃes em etanol e ressuspensÃes em NaNO3 0,1 M. Para as determinaÃÃes de concentraÃÃo de AH nas amostras estudadas, utilizou-se o sal sÃdico de AH microbial comercial (Sigma Aldrich - EUA) como padrÃo. Quantificando-se a amostra de AH apÃs quatro precipitaÃÃes em etanol e ressuspensÃes em NaNO3 0,1 M, obteve-se 783,70 μg/mL. A distribuiÃÃo da massa molar do AH foi avaliada por GPC, em escala analÃtica, utilizando coluna Shodex OHPak-SB806M-HQ e, em escala semi-preparativa, a coluna Superose 6, detectores de Ãndice de refraÃÃo e UV/Vis (280 nm), NaNO3 0,1 M como fase mÃvel, vazÃo de 0,8 mL/min e padrÃes de Dextrana e Pullulan (polÃmeros de volume hidrodinÃmico semelhante ao AH) como marcadores de massa molar (5,2x103 - 7,9x106 Da e 5,8x103 â 8,53x105 Da, respectivamente). A amostra apresentou uma distribuiÃÃo polimÃrica na faixa de 103 a 107 Da, apÃs quatro precipitaÃÃes em etanol e ressuspensÃes em NaNO3 0,1 M, sendo sua massa molar mÃdia da ordem de 105 Da. Foi possÃvel separar fraÃÃes de AH, acima de 105 Da, livre de contaminantes protÃicos, num intervalo de aproximadamente 10 minutos, na coluna Superose 6
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